miRNAs在叶酸缺乏诱导自噬中可能的调控机制研究

【摘要】叶酸是水溶性维生素B9,作为一碳单位的载体,主要参与DNA合成和DNA甲基化这两个重要的生物化学过程。叶酸缺乏在发育异常、衰老、肿瘤等各种疾病中发挥着重要作用,可诱导细胞死亡,其中细胞自噬是细胞死亡的一种类型。自噬是细胞在饥饿条件下维持存活的基本分解代谢机制。本团队前期研究发现叶酸缺乏可诱导小鼠胚胎干细胞发生凋亡且miRNAs是胚胎发育过程中增殖分化和凋亡的关键调控因素,另有研究发现自噬在脊椎动物发育中发挥关键作用。但是叶酸缺乏、自噬和miRNAs三者间的关系尚未明确。因此我们选取小鼠胚胎干细胞为研究模型,探索叶酸缺乏是否可诱发自噬,miRNAs是否参与叶酸缺乏诱导的自噬。进而研究在叶酸缺乏和正常叶酸条件下自噬的关键蛋白的表达状况,筛选、验证参与该过程的miRNAs和mRNAs。以期多角度研究叶酸缺乏,miRNA调控,自噬发生间的关联性。目的以小鼠胚胎干细胞为模型,研究叶酸缺乏、自噬和miRNAs三者间的关联性及可能的调控机理。方法1.分别在低剂量叶酸水平(叶酸缺乏组)和正常叶酸(正常对照组)条件下,培养小鼠胚胎干细胞36h,通过CCK-8实验评估叶酸缺乏对细胞增殖的影响；免疫印记杂交法和荧光定量PCR法分别在蛋白水平和mRNA水平,检测自噬关键蛋白LC3B和Beclinl的表达量变化。2.采用全基因组表达谱芯片和miRNA表达谱芯片检测两组细胞的表达谱。3.通过生物信息学方法,应用Targetscan软件对两组细胞的芯片结果进行靶基因预测,之后进行G0分析、Pathway分析、构建基因间调控网络以及miRNA与靶基因间的负调控网络,最终筛选出与自噬相关的miRNA和mRNA。4.经茎环引物反转录所得产物采用TaqManSmallRNAAssays验证7个与自噬相关的差异miRNA,用SYBGreen法验证4个与自噬相关的差异靶基因。结果1.与正常对照组相比,小鼠胚胎干细胞在叶酸缺乏组培养36h,细胞增殖减慢(P<0.05);LC3B和Beclinl在蛋白水平的表达量均上调(P<0.05),但是在mRNA水平仅LC3B表达量上调(P<0.05)。2.与正常对照组相比,叶酸缺乏组的全基因组表达谱芯片共筛选出差异表达的基因共4607个,其中上调的基因共2599个,下调的基因共2008个。miRNA表达谱芯片共筛选出差异表达的miRNAs共188个,其中上调的miRNAs共70个,下调的miRNAs共118个。3.通过生物信息学方法进行的G0分析提示叶酸缺乏对DNA转录、多细胞生物发育特别是神经系统发育的影响最显著；Pathway分析显示叶酸缺乏主要对多类肿瘤的信号转导通路产生影响。最终筛选结果：自噬PI3K/Akt信号通路的Pik3rl被3个miRNAs(mmu-miR-466d-3p,mmu-miR-669f-3p,mmu-miR-669m-3p)靶向下调,Pik3r3被4个miRNAs(mmu-miR-409-3p,mmu-miR-380-5p,mmu-miR-291a-3p,mmu-miR-345-3p)靶向下调,Pik3r5被1个miRNA(mmu-miR-466K)靶向下调,Akt1被3个miRNAs(mmu-miR-409-3p,mmu-miR-369-3p,mmu-miR-291a-3p)靶向下调,Foxo3同时被mmu-miR-574-5p靶向下调和mmu-miR-212-3p靶向上调。4.荧光定量PCR验证的结果：相对于正常对照组,叶酸缺乏组中除了mmu-miR-345-3p表达下调,其他6个miRNAs(mmu-miR-212-3P、mmu-miR-291a-3p、mmu-miR-380-5p、mmu-miR-409-3p、mmu-miR-466d-3p、mmu-miR-669f-3p)均上调；其中与芯片结果相反的是mmu-miR-212-3P、mmu-miR-345-3p。4个基因中仅Foxo3表达上调1.3倍,差异有统计学意义(P<0.01),而Pik3r1表达下调1.1倍,Pik3r3和Aktl的表达分别上调1.04倍和1.03倍均未发现具有统计学意义(P>0.05)。说明Foxo3可能参与叶酸缺乏诱导的自噬过程主要途径。结论叶酸缺乏条件下培养的小鼠胚胎干细胞可发生自噬,自噬的发生可能通过mmu-miR-212-3P靶向作用于PI3K/Akt信号通路中促进自噬的转录因子Foxo3,使其表达量升高,影响了DNA的转录,自噬相关基因表达上调,从而促进了自噬的发生。在生物体内则可能进一步影响胚胎发育特别是神经系统的发育。本研究首次提出了叶酸缺乏可诱导自噬的发生；首次探索了叶酸缺乏、miRNA与自噬三者间的关系,这也可能为深入研究细胞生长发育调控的机理,特别是神经管畸形的发病机制研究提供了新的思路和可靠的数据。
【作者】董小欢；
【导师】吴建新；
【作者基本信息】北京协和医学院，儿科学，2014，博士
【关键词】叶酸缺乏；细胞自噬；miRNAsmiR-212Foxo3；

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