2009甲型H1N1流感死亡病例致病机制研究

【摘要】流感病毒是引起呼吸道疾病最为重要的病原之一,每年在全球各个国家呈现季节性流行和地区性暴发,据世界卫生组织统计,每年有20-30%的儿童和5-10%的成人会遭到感染,其中300-500万人出现重症感染,约30-50万人死亡。在2009年春季,一种新型三源重配的甲型H1N1流感病毒(2009pandemicinfluenzaH1N1virus,2009pdmH1N1)先后在墨西哥和北美出现后,迅速形成了全球大流行。总体来说这次流感大流行的疾病严重程度较轻,但仍然造成了约28万人的死亡,而且以中青年为主。那么造成这些病例死亡的主要原因是什么?本研究利用流感大流行期间收集的50例死亡病例相关信息和尸检标本为研究材料,通过对死亡病例的临床资料分析、尸检组织分子及免疫病理研究,同时结合体外实验研究,旨在探索天然免疫系统和抗病毒药物在2009年甲型H1N1重症感染中的作用及相关机制,试图阐明及致病机制,同时为重症感染病例的临床用药提供依据。研究内容分以下两部分。第一部分：天然免疫系统在甲型H1N1流感死亡病例中的作用及相关机制研究我们对50例2009pdmH1N1感染死亡病例的肺组织尸检标本进行了宿主免疫反应、病毒载量和组织细胞凋亡等方面进行了系统研究。结果显示,1、发病后7天死亡的病例其肺组织中病毒载量最高,且最长至发病后17天死亡仍能在肺组织中检测到病毒；2、IL-1RA、IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIP-1β和IP-10等7种细胞因子／趋化因子表达水平在死亡病例肺组织中明显增高；而且IL-1RA,MCP-1,MIP-Iβ,IP-10和RANTES等细胞因子／趋化因子的mRNA表达水平与病毒载量呈正相关；3、免疫组织化学染色显示IL-6、IP-10和IL-8在2009pdmH1N1感染死亡病例肺组织细胞和粘膜下腺检测到,且跟病毒抗原在组织中分布类似；4、通过TUNEL染色检测显示,死亡病例的肺组织存在明显凋亡现象,凋亡相关基因FAS和FAS-L表达水平呈现倒置现象,2009pdmH1N1感染死亡病例的肺组织FAS基因表达明显下调,而FAS-L基因表达明显增高且跟病毒载量成正相关,此外,通过免疫组化染色显示Cleavedcaspase-3蛋白在2009pdmH1N1感染死亡病例的肺组织细胞、粘膜下腺和淋巴组织中频繁检测到,其在死亡病例的肺组织中的分布跟凋亡细胞的分布相似。因此,病毒的有效复制以及感染宿主的过度免疫反应在2009pdmH1N1感染死亡病例的致病机制中起作用,凋亡是2009pdmH1N1死亡病例肺组织的病例损伤的重要表现,而FAS-L和Caspase-3参与凋亡的发生路径。第二部分奥司他韦对甲型H1N1流感死亡病例的影响及初步机制研究奥司他韦是临床应用最为广泛的一种神经氨酸酶抑制剂,但使用奥司他韦而造成的临床副作用时有报道,且其临床应用策略和效果存在不同的观点或者异议。因此奥司他韦对于2009pdmH1N1流感死亡病例的可能影响及初步机制研究是必要的。本研究将29例有明确抗病毒用药记录的死亡病例分为两组：奥司他韦药物治疗组(No.=24)和无抗病毒药物治疗组(No.=5),研究奥司他韦的使用与肺组织中的病毒载量、宿主免疫反应和凋亡发生的相关性。在此基础上通过体外细胞感染模型验证奥司他韦对病毒和感染细胞本身的影响。两组死亡病例分析显示,药物治疗组病例中位住院时间为发病后5天(范围：1-12天),中位起始使用奥司他韦的时间为发病后5天(范围1-15天),中位死亡时间为发病后9天(范围：3-17天)；无抗病毒药物治疗组5例病例中2例病例没有住院,另外3例病例分别在发病后3天、4天和8天住院,中位死亡时间为4天(范围：2-8天)。对奥司他韦治疗组和无抗病毒药物治疗组的死亡病例的肺组织的病毒载量、宿主免疫反应分析和凋亡相关基因表达分析显示,药物治疗组的病毒载量略高于无药物治疗组,但无统计学意义(p=0.39),肺组织中IL-1RA、IL-6、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIP-lβ、IP-10和RANTES等细胞因子表达水平在两组间没有明显差异(p>0.05)。但是凋亡相关基因FASLmRNA表达水平在奥司他韦药物治疗组要明显高于无药物治疗组(p=0.01),而TRAILmRNA表达水平在两组间无差异(p>0.05)。分别将季节性H1N1和2009pdmH1N1流感病毒感染THP-1细胞和A-549细胞,同时设置奥司他韦药物处理组和无药物处理组,对两组细胞的凋亡情况和细胞中的病毒复制动力学进行分析,结果显示,感染0h后奥司他韦药物处理组感染细胞内的病毒载量明显低于无药物处理组感染组(p<0.05),但6h和24h后药物处理组感染细胞内的病毒载量明显高无药物处理组,同时24h后奥司他韦药物处理组的THP-1和A549细胞较无药物处理组的细胞凋亡水平是明显升高的(p<0.05)。因此,神经氨酸酶抑制剂奥司他韦能够抑制流感病毒的进入,同时也能抑制病毒的释放,但是奥司他韦能促进感染细胞的凋亡,对于重症感染病例,目前的神经氨酸酶抑制剂奥司他韦临床治疗策略可能并不能降低重症感染病例肺组织中的病毒载量,且有可能可能会促进感染局部组织的病例损伤,同时可能造成体内病毒清除的延迟。
【作者】高荣保；
【导师】舒跃龙；SherifR.Zaki；
【作者基本信息】中国疾病预防控制中心，病原生物学，2014，博士
【关键词】甲型H1N1流感病毒；重症感染；组织免疫病理；先天免疫反应；细胞因子；凋亡；奥司他韦；

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