新型肥大细胞传感器的构建及用于肉毒毒素的检测研究
【摘要】环境监测、食品安全检测、传染病诊断、生物恐怖现场处置等都迫切需要快速、准确检测病原体和生物毒素的方法。传统的检测方法主要有形态学方法，生物化学方法，免疫学方法和核酸检测方法。然而这些方法一般费时费力，或者灵敏度不高，其应用都存在一定的局限。核酸检测方法具有较高的灵敏度，但其需要较纯净的样品并且不能检测蛋白质。基于发光检测的细胞传感器是近几年来发展起来的新型检测技术，这种传感器利用生物或化学发光原理，具有灵敏度高，特异性好，检测速度快等优点，是一项具有巨大潜在价值的技术。本研究目的是制备一种基于水母发光蛋白（Aequorin）的肥大细胞传感器，并对影响检测模型的因素进行研究，最终建立基于细胞传感器的检测技术，并应用于生物毒素的检测。首先将aequorin在大肠杆菌（E.coli）细胞内进行表达，以验证序列的有效性并初步研究aequorin的发光特性。Aequorin的编码序列（AeqD）由NCBI核酸数据库获得，然后对该野生型序列进行优化，优化后的序列（命名为AeqX）进行合成并被克隆到原核表达载体pET-his上。构建好的pET-AEQ被转入到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中进行表达。对表达的蛋白使用Ni2+亲和柱进行亲和纯化。取纯化后的样品和腔肠素孵育后置于发光检测仪上自动加入CaCl2溶液然后进行发光试验和光子计数，以测定蛋白的发光活性。随后对aequorin的发光特性进行了一系列的研究。研究发现aequorin在大肠杆菌内的表达以可溶性形式存在，并且具有较高的活性。发光试验中，加入CaCl2以后，光信号在0.4s内迅速升高到最大，然后迅速衰减，形成了一个明显的发光脉冲峰，这是我们观察到的aequorin的典型发光特征。试验中发现β-巯基乙醇对其发光活性具有显著影响，反应中加入β-巯基乙醇可以显著提高aequorin发光的信号强度，并能有效降低背景信号强度。另外，在0.16ng到1.6μg范围内的aequorin发光活性与蛋白浓度的线性关系良好，决定系数R2达0.993。然后将aequorin在选用的肥大细胞内表达，筛选出稳定表达aequorin的细胞，建立肥大细胞传感器技术。AeqX基因被克隆到哺乳动物细胞表达载体pEGFP-C1上，实现GFP和aequorin的融合表达。将构建好的pEGFP-AEQ表达载体转染到大鼠嗜碱性粒细胞白血病（ratbasophilicleukemia，RBL）肥大细胞（RBL-2H3细胞）中，随后对转染的细胞置于800mMG418的培养基中进行筛选至汇合率低于10%时，换用400mM的G418的培养基中进行筛选。然后采用有限稀释法从稳定细胞群中筛选稳定转染的克隆。使用DNP-BSA和抗DNPIgE抗体建立了肥大细胞传感器的检测模型，随后对可能影响检测的因素，包括腔肠素浓度，腔肠素孵育时间和抗体孵育时间进行了研究。通过该部分工作实现了aequorin在哺乳动物细胞内的高效表达，GFP-Aequorin融合蛋白的发光活性比单独的aequorin的发光提高了约4倍。孵育了抗DNP的IgE抗体的RBL-2H3细胞可以特异地识别DNP-BSA并激活细胞内的信号转导途径进而导致细胞发光。没有抗原存在的情况下或者没有孵育抗体的细胞均不能发光。说明，构建的RBL-2H3细胞可用于特定抗原的检测，特异性较好。细胞被激活后迅速发光然后迅速衰减，形成一个明显的发光峰，发光过程在2min内完成，检测需时较短。完整aequorin的形成需要一定浓度的腔肠素并孵育一定的时间，腔肠素的浓度和孵育时间可能影响aequorin的产率，实验发现，过低浓度的腔肠素导致信号值较低，而过高浓度的腔肠素会造成背景值的升高，5μM的腔肠素浓度能获得最佳的信噪比；太短的孵育时间不能保证aequorin的产率，孵育时间在1h到4h都能获得比较好的发光性能和检测效果。另外试验发现，抗体孵育时间为1h时可以获得较好的发光和检测效果，随着抗体孵育时间的延长，细胞的信号值和灵敏度会迅速下降。另外，为了将肥大细胞传感器用于肉毒毒素的检测，利用B型肉毒毒素（botulinumneurotoxintypeB,BoNT/B）的蛋白受体制备了一种嵌合抗体。21个氨基酸组成的序列（p21）来自BoNT/B蛋白受体突触结合蛋白II（synaptotagminII，SytII）的40-60位氨基酸序列。IgE抗体重链的CH3CH4结构域的序列，由GenBank数据库获得。由一段连接肽序列（(G4S)3）将二者结合起来，构成单链嵌合抗体的序列（p21-CH3CH4），序列3’端添加6×his标签，然后将该序列进行合成，随后被构建入pPICZαA载体上。构建好的pPICZα-p21-CH3CH4被转入到巴斯德毕赤酵母野生菌株X33中进行表达。对表达的嵌合抗体p21-Fcε进行亲和层析和凝胶过滤层析，从而获得纯度较高的嵌合抗体。随后采用免疫印迹和ELISA技术对嵌合抗体及其与BoNT/B的结合能力及特异性进行了鉴定。研究表明嵌合抗体p21-Fcε在巴斯德毕赤酵母表达系统中以可溶的形式实现了高效的分泌表达，经过纯化获得了纯度较高的目的蛋白。经免疫印迹分析，嵌合抗体在还原条件下以单体的形式存在，而在非还原条件下，两个单体之间由二硫键连接形成二价抗体。ELISA试验证实嵌合抗体和BoNT/B之间具有较高的亲和力，但同时与A型肉毒毒素（botulinumneurotoxintypeA,BoNT/A）复合物也有一定的结合。最后将构建的肥大细胞传感器和制备的嵌合抗体结合起来进行肉毒毒素的检测。使用化学偶联方法在DADPA修饰的磁珠表面偶联BoNT/B的多克隆抗体，用于样品的浓缩和并使单体毒素形成多聚体。将肥大细胞用于BoNT/B的检测，首先将构建的发光肥大细胞接种到96孔细胞培养板中，加入一定浓度的嵌合IgE抗体进行孵育，然后和5μM腔肠素进行孵育，孵育结束将培养板中的培养基吸出，每孔加入30μl的BSS缓冲液；进行检测时，取20μl的磁珠和1mL的样品进行混合（PBS，pH7.2）于37℃孵育30min，然后离心并移除部分上清，将剩余的混合物加入到准备好的细胞培养孔中。将96孔细胞培养板置于发光检测仪上，仪器每隔0.5s自动记录发光数据。研究表明细胞传感器对BoNT/B具有较强的信号反应，产气荚膜梭菌ε毒素（Clostridiumperfringensepsilontoxin,ETX）和阴性对照没有发光信号，然而，肥大细胞对BoNT/A也有一定的反应。原因可能是BoNT/A样品中含有血凝素-33对检测造成了干扰。浓度为0.1nM-10nM的BoNT/B均能引发细胞的发光。肥大细胞传感器对BoNT/B的检测下限是0.1nMBoNT/B。通过上述的工作，在大肠杆菌内成功表达了aequorin，对aequorin的发光活性进行了初步研究。发现，发光试验可用于aequorin的定量，检测下限可达0.16ng，是一种有效的定性和定量检测的方法。然后成功将aequorin在哺乳动物细胞内实现了表达，并成功地应用到了肥大细胞传感器中，经过优化，对DNP-BSA的检测下限达到了0.1ng/mL，灵敏度比文献报道的提高了10倍，且检测时间仅需2min。另外制备的嵌合抗体p21-Fcε在巴斯德毕赤酵母表达系统中以可溶的形式实现了高效的分泌表达，而且嵌合抗体和BoNT/B之间具有较高的亲和力。最后将嵌合抗体p21-Fcε和肥大细胞传感器结合可以用于BoNT/B的检测。肥大细胞传感器对BoNT/B的检测下限可达0.1nMBoNT/B，检测时间只需2min。该方法利用了BoNT/B的高亲和力受体和肥大细胞的激活效应，不同于现有的其他方法，是一种新的尝试和探索。
【作者】辛文文；
【导师】王景林；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，军事预防医学，2014，博士
【关键词】水母发光蛋白；肥大细胞传感器；突触结合蛋白II；B型肉毒毒素；IgE嵌合抗体；
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