中药甾体皂苷引起子宫平滑肌收缩的作用机制研究

【摘要】目的宫血宁胶囊（GXN）是利用云南省道地中药材重楼开发的总甾体皂苷（TSSPs）制剂，目前已成为国内妇科专家首推的治疗妇科血症的中成药制剂。在既往的研究中我们已经发现GXN能够增强子宫收缩和促凝血功能是治疗异常子宫出血（AUB）的两个关键药效学基础，并通过植化研究鉴定出十余种甾体皂苷，进行构效关系分析确定了具有螺甾结构的偏诺类皂苷具有显著的促子宫平滑肌收缩活性，并且研究证实了单体Tg引起大鼠血小板聚集、促进凝血的信号转导通路。然而，甾体皂苷引起子宫平滑肌收缩的药理学作用，尤其是作用的信号转导通路尚不十分清楚。本研究的目的在于探索中药甾体皂苷诱导子宫平滑肌收缩的信号转导通路，明确甾体皂苷缩宫作用机制，为寻找作用靶点以及药物的二次开发提供理论依据。内容明确偏诺皂苷Tg诱导的大鼠子宫平滑肌收缩与MLC20磷酸化的关系；探讨PLC-IP3、RhoA/ROK、ERK/MAPK、P38/MAPK、JNK/SAPK和PKC等可能通路的参与与否以及通路间的相互作用；构画Tg引起子宫平滑肌收缩的分子机制图。方法选用120~140g的雌性SD大鼠、采用组织块贴壁法进行原代大鼠子宫平滑肌细胞的分离和培养；利用离体子宫平滑肌收缩实验研究Tg的体外效应和各种抑制剂对Tg作用的影响；采用蛋白免疫印迹（Westernblotting）技术检测可能涉及的信号通路中信号蛋白肌球蛋白轻链（MLC20）、ERK、p38、JNK和钙调结合蛋白（CaD）的磷酸化改变；利用细胞内钙离子标记、激光共聚焦检测平滑肌细胞内钙离子浓度的变化。结果1.Tg引起子宫平滑肌收缩效应的确定以及收缩与MLC20磷酸化效应的关系从总甾体皂苷（TSSPs）中分离提取的单体化合物Tg具有显著的促子宫平滑肌收缩作用，作用的起始浓度为1.25μM，随着给药浓度的增加，收缩效应逐渐增强。已知生理状态下平滑肌细胞内p-MLC20表达水平与平滑肌收缩密切相关，为了揭示Tg诱导的大鼠子宫平滑肌收缩作用是否与平滑肌细胞内MLC20磷酸化关联，采用westernblotting技术评价Tg刺激后胞内MLC20磷酸化水平的改变，发现Tg能够呈剂量和时间依赖性诱导组织细胞内p-MLC20表达水平的升高。MLC20磷酸化反应通常由MLCK介导，应用MLCK特异性抑制剂ML-7能够显著抑制Tg诱导的MLC20磷酸化以及子宫平滑肌收缩。而MLCK主要通过活化的CaM来激活，应用CaM特异性抑制剂W-7也能显著抑制Tg诱导的p-MLC20水平升高及子宫平滑肌收缩效应。2.平滑肌细胞[Ca2+]i对MLC20磷酸化和Tg缩宫作用的影响为了验证[Ca2+]i在Tg引起子宫平滑肌收缩以及MLC20磷酸化效应中的角色，研究首先从检测[Ca2+]i水平的改变入手。以2.5μMTg刺激预先以Fluo4-AM共孵育的子宫平滑肌细胞，激光共聚焦显微镜下可见Tg刺激后，细胞内荧光强度显著性增高，作用12s出现荧光强度的峰值，持续1-2s后很快下降，提示Tg能够刺激子宫平滑肌细胞内[Ca2+]i瞬时升高，形成“钙振荡”。去除细胞外钙或利用L型钙离子通道阻断剂尼群地平以阻断外钙内流，或利用thapsigargin内钙耗竭剂阻断内钙释放，都能显著抑制Tg诱导的子宫平滑肌收缩以及p-MLC20水平的升高。应用PLC/IP3信号通路的特异性抑制剂几乎完全抑制Tg的缩宫作用以及p-MLC20水平升高。另外，RethuniumRed（兰尼碱受体（RYR）的特异性阻滞剂）能够阻止钙离子与受体的结合，从而抑制Ca2+引发的Ca2+释放（CICR），应用54μMRethuniumRed能抑制Tg缩宫作用的发挥。3.RhoA/ROK信号通路在Tg缩宫机制中的调节作用RhoA/ROK信号通路的激活可以通过使MLCP失活而提高p-MLC20浓度。应用ROK特异性抑制剂Y27632的既能够抑制Tg引起的子宫平滑肌收缩，也能抑制平滑肌细胞内p-MLC20升高。4.ERK/MAPK信号通路在Tg诱导的子宫平滑肌收缩中的调节作用MEK特异性抑制剂U0126能够抑制Tg诱导的子宫平滑肌收缩，主要表现为收缩频率的降低；并且，Tg呈剂量和时间依赖地引起子宫平滑肌细胞内ERK1/2磷酸化水平的升高，这一效应能够被U0126完全抑制；Tg还能引起CaD的磷酸化效应增强，可以被U0126部分抑制。为了验证ERK/MAPK通路的激活是否由ras/raf途径介导，检测raf蛋白的表达发现Tg尚能够引起平滑肌细胞内p-c-Raf表达的升高，具有时间依赖性；而应用ras阻断剂可以抑制Tg诱导p-ERK1/2升高。5.p38/MAPK和JNK/SAPK信号通路在Tg诱导的子宫平滑肌收缩中的调节作用已有研究表明在其他平滑肌组织中p38/MAPK和JNK/SAPK信号通路参与收缩调节。我们的研究提示，Tg能够诱导子宫平滑肌细胞内p-p38和p-JNK水平的升高，效应具有时间和剂量依赖性。此外，在Tg引起子宫平滑肌收缩后给予p38通路抑制剂SB203580或JNK抑制剂SB600125均能抑制Tg的促收缩效应以及CaD磷酸化效应。6.参与调节Tg引起子宫平滑肌收缩的信号通路间相互交叉通过各种抑制剂的应用，发现ras/raf/ERK/MAPK信号通路不仅能够引起ERK1/2磷酸化，同时也能促进p-MLC20的产生；引起p-MLC20升高的PLC/IP3信号通路的激活也能引起p-ERK1/2表达水平的升高，而给予CaM抑制剂W-7和MLCK抑制剂ML-7对Tg的促ERK1/2磷酸化效应几乎无影响；0.4μM的PKC抑制剂GFX能够显著抑制Tg引起的子宫平滑肌细胞内p-ERK1/2水平的升高，提示Tg引起的PLC/IP3通路的激活不仅使p-MLC20表达升高，还有可能通过PKC途径介导产生p-ERK1/2水平的升高。结论以代表化合物Tg作为分子探针研究多个信号转导通路在中药甾体皂苷引起子宫平滑肌收缩中的作用机制，我们首次发现：参与甾体皂苷缩宫作用调节涉及多个信号通路的激活、形成通路网络，可能存在多个作用靶点。一方面，Tg的缩宫作用与p-MLC20表达水平升高密切相关。Tg通过激活子宫平滑肌细胞膜钙离子通道引起外钙内流以及PLC/IP3信号通路引起内钙释放使平滑肌细胞[Ca2+]i提高而升高p-MLC20水平；RhoA/ROK信号通路的激活不依赖[Ca2+]i，通过使MLCP失活而提高p-MLC20浓度，起到钙增敏作用，最终引起子宫平滑肌的收缩。Ca2+引发的Ca2+释放（CICR）机制也参与[Ca2+]i的调节，增强Tg的缩宫效应。另一方面，Tg的缩宫作用与p-CaD的升高有关。Tg刺激子宫平滑肌能够引起ERK/MAPK、p38/MAPK及JNK/MAPK信号通路的激活，进而引起CaD磷酸化反应，肌动蛋白与肌球蛋白的结合能力增强，从而引起子宫平滑肌收缩的增强。最后，参与调节的信号通路之间存在交叉，形成信号通路网络，相互影响、精细调控Tg的缩宫作用，这可能就是甾体皂苷有效治疗异常子宫出血、副作用低的分子基础。
【作者】王丽梅；
【导师】从玉文；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】甾体皂苷；子宫平滑肌收缩；PLC/IP3信号通路；rhoA/ROK信号通路；MAPK信号通路；

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