miR-219调控NMDAR信号通路在微波辐射致突触可塑性损伤中的作用研究

【摘要】目的和意义：微波技术在给人们带来极大益处的同时，其生物危害越来越受到关注，可造成包括突触可塑性在内的脑损伤，但致伤机制未明。miRNA是一类单链小分子RNA，具有非常广泛的生物功能，可通过对NMDAR通路的调节影响突触可塑性，但其在微波辐射损伤中的作用研究尚属空白。因此，本研究为深入认识微波辐射致突触可塑性损伤的分子机制、探寻生物标志物和防治靶标提供新思路。材料与方法：（1）采用0和30mW/cm2微波辐射Wistar雄性大鼠48只，隔日辐射1次,共3次，10min/次，于末次辐射后1、7、14和28d，采用光镜、透射电镜观察大鼠海马组织及超微结构。WesternBlot检测大鼠海马组织中NMDAR信号通路相关分子NR1、NR2A、NR2B、CaMKIIγ、CREB及p-CREB蛋白；Real-timePCR检测海马组织NR1、NR2A、NR2BmRNA及miR-219；原位杂交检测海马组织中miR-219分布特点。（2）采用0和30mW/cm2微波辐射经NGF诱导的PC12细胞，于辐射后即刻或6h采用原子力显微镜、扫描电镜、HPLC、免疫荧光及流式细胞术等手段检测突触结构及功能改变；于辐射后1h、6h、12h和24h采用WesternBlot检测PC12细胞NMDAR信号通路中相关分子NR1、NR2A、NR2B、CaMKIIγ、CREB及p-CREB蛋白；于辐射后1h、6h、12h和24h采用Real-timePCR检测PC12细胞中NR1、NR2A、NR2BmRNA及miR-219的表达。（3）利用靶基因预测数据库（TargetScan、miRanda和miRDB）对miR-219靶基因进行预测，通过GeneOntology(GO)和KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes(KEGG)分别对靶基因进行功能分类和通路分析；双荧光素酶活性分析确认miR-219靶基因；稳定转染miR-219过表达和沉默载体至PC12细胞，WesternBlot检测微波辐射后6hmiR-219靶基因CaMKIIγ及NMDAR通路分子NR1、NR2A、NR2B、CREB及p-CREB的表达变化。实验结果：（1）大鼠海马组织及超微结构改变：辐射后1d，大鼠海马组织部分神经元固缩、深染，细胞周间隙增宽；辐射后7d，上述损伤加重，突触间隙不清，囊泡减少，线粒体肿胀、空化；辐射后14d，上述改变呈恢复趋势，至28d基本恢复正常；（2）大鼠海马组织中miR-219分布及表达变化：假辐射组miR-219主要分布于海马颗粒细胞和锥体细胞的胞浆和胞核；辐射后7d，miR-219于上述部位减少（P<0.05或P<0.01），14d未见明显改变；（3）大鼠海马组织NMDAR通路分子表达变化：辐射后1d，NR1、NR2A、NR2B及CaMKIIγ蛋白表达均见增加（P<0.05），辐射后7dp-CREB蛋白表达减少（P<0.05），NR2A和NR2BmRNA表达上调（P<0.05或P<0.01）；（4）突触可塑性损伤细胞模型建立：辐射后6h可见PC12细胞突起缩短、减少，突触表面粗糙不平；Gly、Glu和GABA释放减少（P<0.05），Glu/GABA比值增加（P<0.05）；辐射后即刻可见细胞内Ca2+增加（P<0.01）；（5）PC12细胞NMDAR通路分子表达变化：辐射后1h和6h,NR1、NR2A、NR2B、CaMKIIγ及p-CREB表达均见增加（P<0.05），NR1、NR2A和NR2BmRNA表达上调（P<0.05或P<0.01）；（6）PC12细胞miR-219变化：辐射后6h及12h可见miR-219下调（P<0.05或P<0.01）；（7）miR-219靶基因预测及功能分析：共预测到14个miR-219靶基因，涉及到与突触可塑性相关的生物过程包括钙离子转运、神经递质转运、谷氨酸分泌、长时程增强和长时程抑制等，7个预测出的miR-219靶基因涉及到与突触可塑性相关的通路（；8）miR-219靶基因确认：经Dual-luciferase确认CaMKIIγ为miR-219靶基因（P<0.05）；（9）miR-219与靶基因CaMKIIγ相互作用，及对NMDAR通路分子表达的影响：辐射后6h，miR-219过表达组CaMKIIγ、NR1、NR2A和p-CREB表达显著降低（P<0.05），miR-219沉默组CaMKIIγ、NR1和p-CREB表达显著增加（P<0.05或P<0.01）。结论：（1）30mW/cm2微波辐射可使大鼠海马组织尤其是突触可塑性损伤；NMDAR通路活化参与微波辐射致突触可塑性损伤的病理生理过程。（2）预测到14个与微波辐射致突触可塑性损伤相关的miR-219靶基因，其中7个参与突触可塑性相关信号通路；30mW/cm2微波辐射后miR-219下调可能通过增加靶基因表达促进突触可塑性损伤。（3）30mW/cm2微波辐射可致PC12细胞突触可塑性损伤；微波辐射后miR-219下调可通过增加靶基因CaMKIIγ表达，增强NMDAR信号通路活化，可能是微波辐射造成突触可塑性损伤的重要机制。
【作者】熊璐；
【导师】彭瑞云；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】微波；大鼠海马；PC12细胞；突触可塑性；miR-219；NMDAR信号通路；

【参考文献】
[1]黄程孙云东刘芳.慈溪东部崛起千亿级园区[N].宁波日报,2013-06-26A01.
[2]童辉.润燥止痒胶囊治疗血虚风燥型慢性荨麻疹的临床观察[D].湖北中医药大学,中西医结合临床（专业学位）,2013,硕士.
[3]韩斌.新型武警部队工程项目建设管理模式研究[D].长安大学,结构工程,2013,硕士.
[4]秦倩倩.黄芪甲苷和穿心莲内酯促进鸡异嗜性粒细胞吞噬杀伤E.coil O78作用的分子机制[D].吉林大学,临床兽医学,2013,硕士.
[5]刘超.李大钊的“第三”文明观与马克思主义中国化[D].鲁东大学,马克思主义发展史,2013,硕士.
[6]刘玉明.某炼油厂电子商务系统设计[D].西南石油学院,2004.
[7]朱起悦.机床对仿形精度影响的测试和分析[J].电讯技术.1991(04)
[8]吴剑云.西峰黄土剖面地层CBR值分布规律研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2014,硕士.
[9]范月霞.我国夫妻约定财产制研究[D].东北师范大学,民商法学,2012,硕士.
[10]吕文君.2J85材料液浮陀螺转子的超疏表面制备研究[D].哈尔滨工业大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[11]李洪波,熊励,刘寅斌.项目资源均衡研究综述[J].控制与决策,2015,05:769-779.
[12]张文慧.多中心治理模式下留守儿童教育实践方案探讨[D].华中科技大学,社会工作,2013,硕士.
[13]任学勤.股份公司股东表决权信托的法律问题研究[D].河北经贸大学,民商法学,2013,硕士.
[14]马惠萍.旅行社数据库营销理论与方法研究[D].青岛大学,旅游管理,2004,硕士.
[15]张玉静.餐厨垃圾厌氧水解产挥发性脂肪酸技术研究[D].清华大学,环境科学与工程,2013,硕士.
[16]韩瑜.铁路建设项目环保投资体系界定[D].西南交通大学,环境工程,2014,硕士.
[17]陈清源.毛泽东思想方法论及其现实意义研究[D].湖南师范大学,马克思主义中国化研究,2014,硕士.
[18]胡敏玲.山区高速公路路域生态系统恢复与重建的研究[D].长安大学,交通运输工程（专业学位）,2013,硕士.
[19]李明峰.论格式塔心理学在新闻摄影传播中的运用[D].广西大学,新闻学,2004,硕士.
[20]周佳玮.纳粹德国艺术政策研究[D].华中师范大学,世界史,2014,硕士.
[21]刘海泉.时运电脑公司员工忠诚度研究[D].湖南大学,工商管理,2012,硕士.
[22]杨文远,杨同春,周金林,高建军.粉料气动输送中的流动状态及管道磨损的研究[J].钢铁研究学报.1992(02)
[23]侯凯涛.中国农业银行一级分行网络安全方案设计[D].四川大学,电子与通信工程,2003,硕士.
[24]吴锋,郑应平,毛绪瑾.一类混杂系统的建模与控制器设计[J].控制与决策,1996,01:81-84.
[25]张鑫.Al_2O_3热控涂层的高功率脉冲磁控溅射制备技术研究[D].哈尔滨工业大学,材料加工工程,2014,硕士.
[26]王珍.女性高管与会计稳健性研究[D].北京交通大学,2013.
[27]高愈湘,张秋生,杨航,张金鑫.中国上市公司控制权市场公司治理效应的实证分析[J].北京交通大学学报(社会科学版),2004,02:36-41+57.
[28]王艳.试论思想政治教育工作者的思维创新[D].安徽工程大学,思想政治教育,2012,硕士.
[29]战梅.腕踝针治疗赛前紧张综合征的疗效评定及机制研究[D].第二军医大学,针灸推拿学（专业学位）,2013,硕士.
[30]郭海涛.广州市企业海外投资风险分析与防范[D].广东财经大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[31]田冬姣.大学“教学优秀”外语教师学科教学知识个案研究[D].山西师范大学,外国语言学及应用语言学,2014,硕士.
[32]王芳.民办高校教学成本管理[D].吉林大学,项目管理,2014,硕士.
[33]梁其承.“东南互保”研究[D].吉林大学,中国近现代史,2004,硕士.
[34]张月萍.P-CMM在医药制造企业人力资源开发中的应用研究[D].兰州理工大学,企业管理,2014,硕士.
[35]岳冰.劳动与劳动价值论新探[D].中共中央党校,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[36]陈旭.内蒙古林西县边家大院铅锌银矿床地球化学特征及成因研究[D].吉林大学,岩石学、矿物学、矿床学,2014,硕士.
[37]朱丹,项世龙,薛智敏,王美惠,周斌全,傅国胜.细丝蛋白A在细胞黏附和迁移中的作用[J].中国细胞生物学学报,2014,08:1142-1152.
[38]丁睿.石化工业区绿化景观的规划和效果分析[D].兰州大学,草坪生物学,2013,硕士.
[39]张二金.关于水稻根负向光性光受体和影响因素的研究[D].扬州大学,植物学,2011,硕士.
[40]王丽君.清代徽州进士与徽州社会[D].安徽大学,中国古代史,2014,硕士.
[41]秦山.基于核心竞争力的某国企业发展战略研究[D].北京交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[42]杜良和,程勇,彭志坚.信钢高炉强化冶炼实践[J].炼铁.2001(03)
[43]景毛毛.新世纪藏地叙事研究[D].渤海大学,中国现当代文学,2014,硕士.
[44]程立丽.土壤养分水平和邻接植株差异对三种克隆植物根系构型及生物量分配的影响[D].华东师范大学,生态学,2013,硕士.
[45]李杰.论刑法中的事实认识错误[D].西南政法大学,刑法学,2012,硕士.
[46]彭丹.论我国海外投资保险制度的完善[D].云南财经大学,经济法学,2013,硕士.
[47]郭璠,蔡自兴.图像去雾算法清晰化效果客观评价方法[J].自动化学报,2012,09:1410-1419.
[48]宋松.无纺布果袋调控水蜜桃果实色泽发育的研究[D].浙江大学,果树学,2013,硕士.
[49]胡宏.高炉系统UPS设置方案比较及分析[J].冶金自动化,2013,05:16-18+30.
[50]李美清.马克思主义民族观教育研究[D].北京交通大学,2014.