禽源H9N2 AIV对哺乳动物的感染及其引起肺部细胞因子与蛋白组变化的研究

【摘要】H9N2禽流感（AvianInfluenza，AI）在世界各地家禽群中流行，对养殖业造成了巨大经济损失。H9N2禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus，AIV）是低致病性亚型，但是当其与其他病原混合感染时，病情加重，发病率、死亡率升高。不仅如此，自1999年以来中国大陆和香港地区相继报道了人感染H9N2的病例。虽然人感染H9N2流感病毒后只表现出轻微症状，但是由于该病毒的高度变异性以及容易与其他亚型流感病毒发生重组等特点，可能造成病毒的毒力增强。世界卫生组织（WHO）指出，H9N2被认为是潜在的可能造成人际间的流感爆发或大流行的禽流感病毒，对养殖产业和公共卫生具有极大的威胁。然而迄今为止，有关H9N2AIV在人群中流行情况的调查以及感染哺乳动物和人的应答以及组织病理反应的研究和报道较少，不利于该疫病的防治。基于此，我们首先在山东地区高危人群中进行H9N2的血清学调查，结果表明禽类养殖人员中H9N2抗体阳性率为2.3%，这为该地区禽源H9N2感染人提供了血清学证据。本研究以H9N2山东禽源分离株为研究对象，深入研究其对哺乳动物的感染能力和病理变化；在此基础上以病变明显的肺脏为靶器官，通过荧光定量PCR、ELISA和Western方法对H9N2感染后的小鼠肺脏内细胞因子的表达变化进行研究；同时利用双向电泳（2DE）对小鼠肺脏组织中的差异蛋白质进行分析。从而为深入了解H9N2病毒引起的哺乳动物肺部损伤机制以及开发抗流感病毒药物靶标的研究提供理论基础。本研究分以下四部分内容：1.H9N2禽流感病毒血清学调查为了解山东地区H9N2禽流感病毒在禽类从业人群中的感染状况，2011年12月至2012年2月，采集禽类从业人员382名及非从事动物工作的健康人员100人的全血样本，采用改进的血凝抑制和微量中和实验检测H9N2抗体。以≥40为临界值，通过HI或MN实验结果显示禽类从业人群有9例(9/382=2.3%)呈现H9N2抗体阳性，而100名非从事动物相关工作人员的H9N2抗体均为阴性。调查中，虽然未见H9N2感染的临床病例报告，但不排除潜伏感染或亚临床感染的可能性。调查表明禽类养殖业是感染禽流感的危险环境，对禽类从业人员健康状况的持续监测有助于评估H9N2禽流感病毒对人类健康和公共卫生的威胁。2.H9N2AIV山东分离株基因序列特性分析及对哺乳动物的感染参照GenBank上的H9N2AIV的全基因序列，设计分别扩增H9N2AIV8个基因片段的特异性引物，测定5株H9N2AIV山东分离株全基因序列并分析其遗传进化和分子特点，并以BABL/c小鼠和豚鼠为模型评价其致病性和传播能力。HA及NA进化树结果表明5株病毒均属于CK/Beijing谱系，其中2株病毒的HA具有人样受体结合特性（Leu234），3株病毒具有禽样受体结合特征（Gln234）。HA裂解位点分析表明，5株病毒均具有低致病性AIV特征；个别病毒的潜在糖基化位点存在增加或缺失现象。攻毒BABL/c小鼠后，CK/SD/W3和CK/SD/ch这2株病毒能够在小鼠肺部复制，平均病毒滴度可达到5.3±0.12log10TCID50/g和4.75±0.2log10TCID50/g；病理切片显示间质性肺炎病变，通过免疫组化在细支气管上皮细胞检测到病毒。在豚鼠模型的感染实验结果显示，CK/SD/W3和CK/SD/ch能在鼻甲、气管和肺脏复制，2株病毒在豚鼠鼻甲骨复制能力较在肺脏的复制能力高，平均病毒滴度分别为3.4±0.55log10TCID50/g和4.2±0.42Log10TCID50/g；且传播实验表明CK/SD/W3能通过直接接触传播，但并未证实其可通过气溶胶传播。本研究表明，山东分离株中病毒能不经适应就感染小鼠和豚鼠，具备感染哺乳动物的能力，应加强对流行毒株的监控以评估其对人类公共卫生的威胁。3.H9N2AIV感染小鼠肺脏细胞因子的表达根据GenBank中小鼠的细胞因子和趋化因子的基因序列，选择其中的保守区，利用Premier5.0软件设计相应的引物，建立了相应的荧光定量PCR方法，该方法具有可靠的特异性、重复性和敏感性。利用该技术对感染H9N2(CK/SD/W3)的小鼠肺脏中11种细胞因子和趋化因子mRNA的表达进行检测，并结合ELISA和WesternBlot验证相关细胞因子在蛋白水平的表达情况。研究结果显示，H9N2AIV感染的小鼠肺脏组织样本中IFN-γ，IL-6，MIP-1α，CCL5及IP-10mRNA含量有2倍~20倍不同程度升高，其中CCL-5在第2天增长15倍，IFN-γ在第6天增长20倍。应用ELISA和Westernblot对上升的全部或部分细胞因子进行了验证，其蛋白水平的表达趋势与荧光定量结果一致。H9N2AIV感染后的小鼠肺脏中，IFN-γ为主要抗病毒效应因子，而IP-10，IL-6，CCL-5和MIP-1α分别在促炎性反应中起一定作用。总之，本研究提供了H9N2AIV感染小鼠肺组织后免疫应答相关数据，为进一步了解H9N2对哺乳动物宿主的感染特性奠定了基础。4.H9N2AIV感染小鼠肺脏的差异蛋白组学分析利用蛋白组学研究方法双向凝胶电泳（2-DE），比较H9N2(CK/SD/W3)感染小鼠引起的肺脏蛋白质组差异。试验对病毒感染后12h和72h两个时间点进行检测，寻找攻毒组和对照组重叠比值（ratio值）大于2并且符合t检验（p<0.05）蛋白点，通过质谱分析共鉴定出31个蛋白，其中感染12h时有4个差异蛋白，72h有27个差异蛋白。这些蛋白与病毒-宿主相互作用有关，功能主要涉及骨架蛋白、应激反应、抗氧化反应、蛋白的转录或表达调节等。本研究结果表明上调的细胞骨架蛋白主要有微管相关蛋白CAP-Glydomain-containinglinkerprotein1、RabGTPase-activatingprotein1-like以及膜联蛋白annexinA4，它们通过复杂的囊泡运输和微管系统进行物质交换和信息传递。应激反应蛋白HSP27和三种抗氧化蛋白ChlorideIntracellularChannelProtein1(CLIC1)，peroxiredoxin-6(Prx6)以及peroxiredoxin-2(Prx2)都显著上调，说明流感病毒的感染使内源性的氧化/抗氧化平衡受到干扰了，通过上调抗氧化蛋白来缓和氧化带来的损伤。Ubcprotein，ubiquitin-B及ISG15蛋白与泛素-蛋白酶途径（UPP）相关。本实验为进一步认识流感病毒与宿主的相互作用，禽源流感病毒感染哺乳动物机制以及寻找新的流感药物靶标提供思路。
【作者】黄蓉；
【导师】柴同杰；
【作者基本信息】山东农业大学，预防兽医，2014，博士
【关键词】H9N2亚型禽流感病毒；血清学调查；细胞因子；小鼠；蛋白质双向电泳技术；

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