基因表达谱分析miR-431小鼠耳聋的机制及小耳畸形患儿听觉发育研究

【摘要】第一部分基础研究：基因表达谱分析miR-431导致小鼠耳聋的分子机制目的：miR-431转基因小鼠ABR反应阈值升高,提示miR-431可能参与遗传性耳聋的调控。本研究通过基因表达谱分析,筛选鉴定miR-431转基因与野生型小鼠内耳组织中差异表达的基因,为探讨miR-431导致小鼠耳聋的分子机制奠定基础。方法：提取ABR反应阈值升高的miR-431转基因小鼠和ABR反应阈值正常的野生型小鼠耳蜗总RNA,进行RNA测序。通过对测序结果进行生物信息学分析及GO注释,得到差异表达基因。然后,通过miR-431靶基因预测和遗传性耳聋基因信息库交叉筛选,得到miR-431介导的调控遗传性聋的候选基因。最后,通过Real-timeRT-PCR方法验证RNA-seq数据可靠性；通过基因克隆、双荧光素酶报告基因系统(Luciferase)验证miR-431靶基因。结果：1、miR-431转基因小鼠ABR反应阈较野生型小鼠升高。A系Tg组小鼠平均听阈为42.3±14.7dBSPL,Wt组小鼠平均听阈为27.3±6.9dBSPL;B系Tg小鼠平均听阈为34.8±6.9dBSPL,Wt小鼠平均听阈为27.5±4.5dBSPL。2、通过分析得到miR-431转基因小鼠较野生型小鼠表达差异大于1.5倍的基因2344个,大于2倍的有921个。其中上调基因,大于100倍的7个,10-100倍的77个,2-10倍的627个；其中下调基因大于100倍的4个,10-100倍的12个,2-10倍的194个。3、通过差异表达基因与遗传性耳聋基因突变数据库联合分析,得到16个表达变化的耳聋基因,其中14个基因在Tg小鼠中表达下调,它们是CLDN14.COL11A2、COL2A1、COL4A4、COL9A2、ESRRB、GJB2.MITF、OTOF,POU4F3,SEMA3E、SIX5、SOX10、USH1C。2个基因表达上调,它们是：GJB3、GRHL2。4、通过差异表达基因与遗传性耳聋基因突变数据库和miR-431预测的靶基因数据集做联合分析,鉴定了8个基因可能是miR-431介导的调控遗传性聋的候选基因,COL4A4、ESRRB、GJB2、MITF、OTOF、USH1C、SEMA3E和GRHL2。5、Real-timeRT-PCR方法验证了8个基因与RNA-seq结果一致。6、双荧光素酶报告基因系统验证COL4A4、SEMA3E是miR-431调控的靶基因。结论：miR-431可能通过调控COL4A4、SEMA3E表达影响小鼠听力。第二部分临床研究：小耳畸形患儿听觉发育研究目的：比较双侧先天性耳道闭锁、小耳畸形儿童与听力正常儿童听力及早期听觉发育的差别,分析佩戴软带骨锚式助听器(Bone-anchoredhearingaid,Baha)对患儿改善听力及听觉发育的影响。方法：软带Baha组共16例双侧先天性耳道闭锁、小耳畸形儿童,<4岁组6例,4-6岁组10例,29例正常听力儿童作为对照组。<4岁组患儿分别在3个测试时间点(佩戴软带Baha前、佩戴6个月及12个月后)应用婴幼儿有意义听觉整合量表(Infant-ToddlerMeaningfulAuditoryIntegrationScale,IT-MAIS)评估听觉发育情况。4-6岁组患儿分别在3个测试时间点应用有意义听觉整合量表(MeaningfulAuditoryIntegrationScale,MAIS)评估听觉发育情况,并在声场下行纯音测听(puretoneaudiometry,PTA)及应用普通话词汇相邻性单音节及双音节词表(ChineseMandarinlexicalneighborhoodtest,MLNT)检测言语识别率。结果：<4岁组患儿在3个测试时间点的IT-MAIS平均得分分别为41±24%、60±22%和73±7%。4-6岁组患儿在3个测试时间点的MAIS平均得分分别为66±7%、90±5%和99±2%。4-6岁组患儿声场下裸耳平均听阈为63±6dBHL,佩戴软带Baha后听阈提高至31±4dBHL。应用双音节易词测得的平均言语识别率(speechdiscriminationscore,SDS)为74±19%、86±16%和95±4%；双音节难词平均SDS为48±18%、73±15%和81±7%；单音节易词平均SDS为55±17%、74±22%和83±14%；单音节难词平均SDS为31±14%、61±15%和71±13%。结论：双侧先天性耳道闭锁、小耳畸形儿童早期佩戴软带Baha能够有效提高听力,听觉发育水平可接近健听婴幼儿。
【作者】张颖；
【导师】陈晓巍；朱大海；
【作者基本信息】北京协和医学院，耳鼻咽喉科学，2014，博士
【关键词】miR-431；转基因小鼠；RNA-seq；COL4A4；SEMA3E；骨锚式助听器；软带；双侧耳道闭锁；听觉发育；言语测听；

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