基于微流控芯片技术COPD向肺鳞癌恶性转化的机制研究

【摘要】背景：近年来，慢性肺部疾患，包括慢性支气管炎、哮喘、肺结核、肺部瘢痕病灶、尘肺等作为与肺癌发生发展相关的重要因素越来越被肯定和关注。统计显示，患有慢性阻塞性肺病（COPD）的患者，其肺癌发病率是一般人群的4～5倍，因此，目前COPD已经被认为是诱发肺癌的独立危险因素。在COPD诱发肺部癌变过程中，慢性炎症主要通过改变肿瘤细胞的生存环境、激活，由多种蛋白及炎性介质参与的内源性或外源性信号通路等途径促进癌症的发生与发展。然而从COPD向肺鳞癌的恶性转化过程中究竟有哪些炎症因子或者炎症相关的分子通路、网络在起作用仍不清楚。为了进一步揭示慢性炎症恶性转化的本质，我们不仅要注重研究与该过程相关联的信号通路和关键因子，也要注重研究方式及研究手段的改进。现有研究方法的根本不足在于所采用的技术方式没能很好地模拟体内真实的炎症微环境，导致体外研究结果不可靠。因此，为了探讨COPD向肺癌恶性转化的分子机制，迫切需要一种能够较好地模拟体内微环境、同时检测多种炎症因子、实现高通量检测的新技术手段，以提高检测的准确性和可靠性，为肺部疾患恶性转化机制的研究提供客观的依据。发展中的微流控芯片技术能够满足上述要求，可望为这种检测提供可靠的技术支持，成为研究肺癌机制新的技术平台。因此，本研究拟充分发挥微流控芯片技术的优势，在微流控芯片平台上完成COPD向肺鳞癌恶性转化的分子机制研究，同时辅以动物体内实验加以验证，为肺部慢性炎症恶性转化寻找潜在的分子靶点。本研究分为以下四部分。研究方法：1.基于微流控芯片技术可疑致癌炎症因子的高通量筛选构建了一个适于肺癌组织和癌旁组织炎症因子筛选的高通量的三维细胞培养微流控芯片平台，选取57例肺鳞癌合并COPD的患者为研究对象，进行了微流控芯片平台上细胞三维培养、炎症因子检测，同时利用传统分子生物学技术Westernblot、real-timePCR、免疫组织化学检测了肺癌组织和癌旁组织炎症因子的差异。2.基于微流控芯片技术COPD香烟再暴露致恶性转化的研究构建了一个适于支气管上皮细胞香烟再暴露研究的微流控芯片平台，选取10例肺鳞癌合并COPD并有长期吸烟史的患者为研究对象，进行了支气管上皮细胞原代培养，在微流控芯片平台上对已有长期香烟暴露史的支气管上皮再次进行香烟的暴露，观察在长期香烟再暴露过程中支气管上皮细胞是否发生恶性转化，检测活性氧（ROS）水平、相关分子通路变化、锚着独立性、上皮间质转化（EMT）以及染色体畸变。3.基于仿生肺芯片NF-κB、COX2、STAT3、GRP78在支气管上皮细胞恶性转化的作用研究构建了一个模拟人体肺部结构的仿生肺芯片，支气管上皮细胞系16HBE与巨噬细胞共培养，其中上皮细胞采用“气液界面”培养，苯并芘致癌物诱导上皮细胞恶性转化，同时抑制NF-κB、COX2、STAT3、GRP78等相关分子水平，检测上皮细胞恶变的指标如细胞形态学、细胞周期、锚着独立性、裸鼠成瘤以及相关分子通路变化，观察炎症是否促进了上皮细胞的恶性转化，验证炎症相关因子的致癌作用。4.基于动物肺癌模型NF-κB、COX2、STAT3、GRP78在支气管上皮恶性转化的作用研究采用熏烟联合脂多糖（LPS）支气管灌注的方法建立了大鼠COPD模型，在此基础上又利用致癌物三甲基胆蒽（MCA）和二乙基亚硝胺（DEN）支气管灌注法建立了大鼠肺癌模型，同时采用体内RNA干扰技术将大鼠体内NF-κB、COX2、STAT3、GRP78下调，观察比较单纯致癌组、COPD致癌组以及RNA干扰后大鼠肺癌发生率的差异从而验证上述四个因子是否是炎症向肿瘤恶性转化的关键节点。结果：1.基于微流控芯片技术可疑致癌炎症因子的高通量筛选成功构建了一个能够进行炎症恶性转化研究的多单元集成、双水平对照、多通道连接的高通量微流控芯片实验室，在此平台上完成了57例肺鳞癌患者原代肺癌细胞和癌旁支气管上皮细胞三维培养，发现p-IKKβ、p-IκBα、NF-κB、GRP78、p-IRE1α、XBP1、COX2、STAT3及CyclinD1在肺癌细胞中的表达要明显高于癌旁支气管上皮细胞的表达（P<0.05），免疫组织化学检测、Westernblot检测以及real-timePCR检测结果与上述芯片平台筛选结果一致。2.基于微流控芯片技术COPD香烟再暴露致恶性转化的研究成功构建了一个自动多浓度梯度发生的香烟再暴露微流控芯片平台，研究发现低剂量CSE暴露可导致人支气管上皮细胞增殖速度加快，同时伴有胞浆ROS产生以及ROS相关炎症通路GRP78/IRE1α,IKKα/NF-κB和PI3K/AKT/mTOR的激活，长期低剂量CSE暴露还可以导致支气管上皮细胞表现为病理性核分裂象增多的高度异型性状态，同时还可以促进上皮-间质转化、锚定独立性生长以及染色体畸变，而应用ROS、GRP78、NF-κB以及PI3K抑制剂后，上述各个指标的变化被逆转或减弱。3.基于仿生肺芯片NF-κB、COX2、STAT3、GRP78在支气管上皮细胞恶性转化的作用研究成功构建了一个模拟体内肺脏结构的仿生肺芯片，研究发现支气管上皮细胞与巨噬细胞共培养后培养基中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显高于单独支气管上皮细胞培养的水平，且随着传代次数的增加各因子水平随之升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；苯并芘可以导致支气管上皮细胞形态学恶变、细胞周期加快、接触抑制消失、锚着独立性生长以及裸鼠成瘤等恶性表现，而巨噬细胞可以加速支气管上皮细胞恶性转化，表现为上述各个指标出现的代次提前，抑制NF-kB、STAT3、COX2、GRP78相关炎症因子后，上述各个指标出现的代次明显延长，差异具有统计学意义（P<0.05）。4.基于动物肺癌模型NF-κB、COX2、STAT3、GRP78在支气管上皮恶性转化的作用研究成功构建了大鼠COPD模型和肺鳞癌模型，研究发现COPD大鼠外周血白细胞总数和中性粒细胞分类较对照组明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），COPD大鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）白细胞总数和中性粒细胞均明显增高（P<0.01），单核-巨噬细胞所占比例明显降低（P<0.01）；经过肺癌造模后发现COPD+致癌组肺癌发生率（85.7%）较单纯肺癌组（30.0%）高，差异具有统计学意义（P<0.05）；COPD+NF-κB抑制+致癌组肺癌发生率（22.2%）较COPD+致癌组（85.7%）低，差异具有统计学意义（P<0.05）；COPD+COX2抑制+致癌组肺癌发生率（25.0%）较COPD+致癌组（85.7%）低，差异具有统计学意义（P<0.05）；COPD+STAT3抑制+致癌组肺癌发生率（30.0%）较COPD+致癌组（85.7%）低，差异具有统计学意义（P<0.05）；COPD+GRP78抑制+致癌组肺癌发生率（30.0%）较COPD+致癌组（85.7%）低，但差异无统计学意义（P>0.05）。结论：1.本研究筛选出NF-κB、COX2、STAT3、GRP78及其相关的因子IKKβ、IκBα、IRE1α、XBP1、CyclinD1为参与COPD向肺鳞癌转化的可疑炎症因子。2.长期低剂量CSE暴露可以导致重度吸烟COPD患者支气管上皮细胞发生恶性转化，其中ROS以及相关的GRP78、NF-κB以及PI3K分子通路是恶性转化的主要分子机制，这为吸烟相关的肺癌防治提供了一个新的靶点。3.基于仿生肺芯片恶性转化模型发现，NF-kB、STAT3、COX2、GRP78是支气管上皮细胞炎症恶性转化中的关键节点，而TNF-α或IL-1β/NF-kB，IL-6/STAT3，COX2/ERK，GRP78/IRE1是支气管上皮细胞恶性转化的主要分子通路。4.经过建立大鼠COPD模型和肺癌模型发现COPD可以促进大鼠肺癌的发生；NF-κB、COX2、STAT3在COPD向肺鳞癌恶性转化中起到关键作用。
【作者】李恩成；
【导师】王琪；
【作者基本信息】大连医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】微流控芯片；COPD；肺癌；恶性转化；

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