基于靶序列环化的新型滚环扩增方法的建立及其应用

【摘要】核酸扩增是一项基本的生物技术，在医疗、农业、环境监测和取证等各个方面有着不可替代的作用。传统的核酸扩增使用聚合酶链式反应，即PCR技术。作为一种经典的扩增检测方法，同以其为基础发展而来的实时荧光定量PCR（qPCR）技术，被广泛的应用于核酸的扩增与检测领域。但这一技术在食品领域应用时会出现易受污染产生假阳性，有聚合酶抑制剂时使用困难，背景核酸大量存在时灵敏度大幅降低等问题。这些缺点限制了PCR直接用于检测食品中外源微生物。同时，作为一种变温扩增技术，PCR特异性的发挥需要精确的控温仪器，不符合基层现场快速检测的要求。因此需要开发一种新的核酸扩增技术，能够摆脱对精确控温仪器的依赖，同时能够从食品中检测出外源病毒和细菌，即能够在大量背景核酸存在的条件下特异性检测目标序列的存在，以达到在食品领域真正广泛应用的目标。滚环扩增（Rollingcircleamplification，RCA），是一种在等温条件下就能特异性扩增目标片段的扩增技术，主要利用环状模板和具有链置换能力的DNA聚合酶环绕模板进行周期性的复制。常见技术应用为都以锁式探针RCA（padlock-RCA）引发扩增。虽然灵敏度高，但也有单链探针不稳定、探针与模板容易错配、扩增产物并非目标序列而是互补的探针自身的缺点。针对于此，本文使用了一种全新的目标成环RCA（Target-circularizationRCA，TC-RCA）：利用限制性内切酶酶切样品，产生具有9nt粘性末端的序列；其次，设计与目标序列粘性末端完全互补配对的双链接头，在连接酶的作用下同目标序列连接成环；利用具有链置换活性的DNA聚合酶，在两条引物的作用下引发超分支-RCA（Hyper-branchedRCA）；最后，扩增产物再经过限制性内切酶酶切，得到扩增后的目的片段。在此基础上，利用高特异性的DNA连接酶、生物素修饰接头、链霉亲和素磁珠以及磁性分离等手段，构建了磁珠辅助的TC-RCA技术。该项技术能够在等温条件下从大量背景核酸中检测出目标序列，从根本上解决了检测特异性和灵敏度之间的矛盾关系，特别适用于检测食品中有害微生物的存在。论文主要从以下几个方面研究建立特异性核酸检测方法。（1）TC-RCA的可行性，证明了TC-RCA具有在无背景核酸条件下扩增目标DNA片段的能力，敏感度为6×104个拷贝分子。同时，接头能稳定结合于固相磁珠表面，并且设计的接头固定于固相表面后不影响连接与扩增，为TC-RCA在芯片上实现目标成环等温扩增提供了技术支持和理论依据。（2）TC-RCA可以在大量背景核酸中检测出目标序列，敏感度达到6×106个拷贝分子，但结果伴有非特异性扩增。使用连接忠实度较高的TaqDNA连接酶进行连接，没有能够达到提高特异性的目的。主要是由于TaqDNA连接酶在非正常的缓冲液条件下，区别错配能力降低所致。说明TC-RCA已经初步具备成为一种新型检测方法的能力，同时为后续的实验提供了解决问题的思路和依据。（3）通过磁珠辅助将扩增子与背景DNA和TaqDNA连接酶分离，同时结合其它条件的优化探索，使得磁珠辅助的TC-RCA可以在高背景核酸存在的条件下特异性地扩增目的片段，敏感度为60个拷贝分子，并且没有任何非特异性扩增出现。经过对各个步骤的精简优化，检测结果24h之内即可获得。磁珠辅助的TC-RCA通用性强，更适用于基层和现场快速检测。（4）磁珠辅助TC-RCA适用于检测水产品中有害细菌，SYBRGreenI染色结果表明该技术可以特异地检测出水产品中的外源细菌，最低检测限达到100个细菌基因序列拷贝分子。同其它检测水产品中有害微生物的方法相比，本方法不需要进行增菌实验，检测的结果可以直接反应食品被细菌污染的最初状态。同时反应不依赖精密控温仪器，常用水浴锅就满足检测要求，为基层现场快速检测食品中细菌提供了一种强有力的技术手段。
【作者】王星宇；
【导师】梁兴国；
【作者基本信息】中国海洋大学，食品科学，2014，博士
【关键词】滚环扩增；等温检测；链霉亲和素磁珠；水产食品中有害细菌；

【参考文献】
[1]王会龙.基于固话短信的远程数据采集的研究与应用[D].西北工业大学,信号与信息处理,2004,硕士.
[2]杨辉.高新技术产业化动力机制研究[D].武汉理工大学,产业经济学,2004,硕士.
[3]姬宪甜.论韩少功对小说可能性的探索[D].河北师范大学,文艺学,2014,硕士.
[4]赵宇.深圳华侨城社区热环境评估及优化策略研究[D].哈尔滨工业大学,建筑学,2013,硕士.
[5]毕瑶.基于反射纵波的压力容器压力测量方法研究[D].浙江大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[6]孙启成.江西省稻农应用水稻农业技术的行为研究[D].江西农业大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[7]王方春.中国居民收入极化的测度与分解研究[D].浙江工商大学,统计学,2012,硕士.
[8]陈雯雯.运用销售百分比预测现金流的改进及应用研究[D].长安大学,会计,2013,硕士.
[9]张忠妹.浙江省蚕桑生产经济效益研究[D].南京农业大学,农业生物环境与能源工程,2013,硕士.
[10]呼斯乐.办公空间光环境营造与光污染的防治[D].内蒙古师范大学,室内设计（专业学位）,2013,硕士.
[11]董立雅,嵇天浩,王继梅,冀志江.Ag/石墨烯复合材料的制备及其对邻氨基苯甲酸甲酯的SERS效应[J].功能材料,2014,04:4067-4071+4075.
[12]柳乐.智力障碍学生抑制控制及其与问题行为的关系研究[D].华东师范大学,特殊教育学,2013,硕士.
[13]徐凤安.高阶无静差采样控制系统的动态综合[J].自动化学报,1982,02:154-162.
[14]张哲.小微企业金融服务创新研究[D].西南大学,金融学,2013,硕士.
[15]王征宇,蔡德发.黑龙江省石墨资源税改革研究[J].经济研究导刊,2014,26:178-179.
[16]刘慧.不同剂量小檗碱对酒精性心肌损伤大鼠的保护作用研究[D].湖南师范大学,内科学,2014,硕士.
[17]王瑞.围术期输血指征评分方案应用于脊柱外科大量失血手术的临床研究[D].遵义医学院,麻醉学,2013,硕士.
[18]刘丽艳,王海涌,郑丽英.基于粗集理论的决策规则约简算法的研究与应用[J].兰州交通大学学报,2004,06:78-80+111.
[19]马芸芸.基于ARM和ADE7878的多功能电力监测装置[D].南京理工大学,控制工程,2012,硕士.
[20]赵赟.基于承销商与发行商博弈行为视角的IPO发行与抑价研究[D].哈尔滨工业大学,金融学,2014,硕士.
[21]周国江,刘红斌,刘丽来,邢善超,杜新伟.PVP辅助水热法制备Fe_2O_3/石墨烯纳米复合材料[J].黑龙江科技大学学报,2014,01:70-74.
[22]贺振华,J.Lai,G.H.F.Gardner.多次覆盖地震资料的叠前偏移[J].石油地球物理勘探,1986,01:11-22+31.
[23]李晓陀.检查点激酶Rad3和Rad17在重组修复中作用机制研究[D].海南大学,发育生物学,2013,硕士.
[24]曾俊琦.一种24位Delta-SigmaA/D转换器的设计与实现[D].北京交通大学,2015.
[25]倪海.汪龙德主任医师从湿论治脾胃病临床经验总结[D].甘肃中医学院,中医内科学,2014,硕士.
[26]沈丹.论蔡畅的妇女教育思想[D].华东师范大学,马克思主义中国化研究,2013,硕士.
[27]张大印.基于协同过滤的可信服务选择研究[D].南京邮电大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[28]刘婧,华薇娜.国内精算研究文献的定量分析[J].情报科学,2004,05:610-615+620.
[29]王策.东软商用项目团队管理问题分析及对策[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[30]张超.细胞抑制剂的伞型序约束两步剂量寻找方法[D].东北师范大学,概率论与数理统计,2012,硕士.
[31]陈超伦.面向分布式地理模型共享的数据表达模型研究[D].南京师范大学,地图学与地理信息系统,2012,硕士.
[32]寇学俊.盐敏感性高血压家系血管紧张素Ⅱ-2型受体（A1675G）基因多态性研究[D].济南大学,内科学,2012,硕士.
[33]李民.机构投资者持股对企业绩效的影响研究[D].山东财经大学,企业管理,2014,硕士.
[34]彭军民.基于神经网络的货币识别研究[D].西安理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[35]杨念祖.网上支付概况[J].电脑与信用卡.1999(06)
[36]赵京.硒在土壤—苜蓿系统中的增益效应研究[D].河南农业大学,土壤学,2012,硕士.
[37]唐秉雄.福建省民办高校教师流动管理研究[D].华侨大学,企业管理,2013,硕士.
[38]李经纬.电解铝阳极导杆铝—钢相位摩擦焊技术研究[D].兰州理工大学,材料加工工程,2014,硕士.
[39]陈泓屺.基于动态背景差分法的车辆检测与追踪[D].广东工业大学,模式识别与智能系统,2013,硕士.
[40]张楠.工业计算机控制系统在岩土钻测装备中的应用研究[D].吉林大学,2010.
[41]魏滔.农村商业银行贷款风险管理研究[D].山东财经大学,金融（专业学位）,2013,硕士.
[42]张蕊.Deep Web环境下重名实体识别研究[D].东北大学,计算机软件与理论,2010,硕士.
[43]郏东耀,邹胜雄.基于动态结果影响的轨道维修工评价方法[J].系统工程理论与实践,2015,04:1005-1010.
[44]郭禹.汞对长江华溪蟹（SINOPOTAMON YANGTSEKIENSE）细胞及分子水平的影响[D].山西大学,动物学,2004,硕士.
[45]黄博,李玲,凌道盛,陈星耀.G_(max)附加衰减模式及其对场地地震响应影响[J].浙江大学学报(工学版),2014,07:1170-1179.
[46]赖锡煌.基于ADAMS虚拟平台的多关节机器人动力学分析[D].北方工业大学,2005.
[47]周沫.超高频射频识别系统标签检测性能研究[D].南京邮电大学,电路与系统,2013,硕士.
[48]叶飞跃.基于自适应哈希链的分布式频繁模式挖掘算法[J].系统工程与电子技术,2005,03:560-564.
[49]左明宗.OTA系统中的安全机制研究[D].湖南大学,软件工程,2011,硕士.
[50]宋小宏.对网络信息技术与化学课堂教学整合的“主题化探究”模式的实践研究[D].上海师范大学,教育,2004,硕士.