小麦应答农杆菌转化相关基因的筛选及TaUGT在小麦与农杆菌互作过程中的功能研究

【摘要】小麦是目前世界上主要的粮食作物之一，小麦的产量与品质直接关系到粮食安全。转基因技术是目前小麦基因改良的重要方法之，其效率高低直接影响小麦遗传改良进程。备受关注的小麦基因枪转化法容易引发转基因高嵌合度、多位点整合及诱发转基因沉默等问题，农杆菌介导转化法则可很好地解决或缓解上述问题，但农杆菌介导转化小麦的效率亟待提高。本研究从小麦与农杆菌互作的分子机制出发，探索影响农杆菌介导转化小麦转化效率的功能基因，取得了如下主要结果：1、利用抑制性差减杂交、蛋白质组学、数字化表达谱测序来筛选小麦对农杆菌侵染的应答基因，分别得到20、90和4,889个差异表达基因。其中，数字化表达谱测序灵敏度最高。差别基因聚类分析表明，参与物质代谢途径的基因所占比例最大，其次是次生代谢物质合成通路。其中，超过3%的差异表达基因参与到目前已经明确的植物-病原体互作通路，而在生物素合成通路、花生四烯酸代谢通路、光合作用生物通路差异表达基因定位最少。2、KEGG通路分析表明，小麦UDP葡萄糖基转移酶（TaUGT）编码基因主要参与抗坏血酸代谢通路和药物代谢-细胞色素P450通路。而这两条通路都与植物抗病相关。Real-timePCR分析显示，TaUGT在小麦受到农杆菌侵染12小时后，表达量大幅上调，并随着共培养时间延伸而逐渐下降。表明该基因是在农杆菌侵染小麦细胞的初期起了较重要的调控作用。3、基因结构分析表明，TaUGT为真核生物中少见的不存在内含子的核编码功能基因之一，与二倍体祖先种的同源性极高，进化上十分保守。经Southern杂交分析及将TaUGT基因序列向GrainGenes数据库的已定位小麦EST数据库进行blastn比对，推测TaUGT在小麦基因组中存在9个拷贝，在A、B、D基因组上各存在3个拷贝。亚细胞定位显示，TaUGT定位在细胞膜上，可跨膜发挥功能。4、TaUGT功能分析发现，过表达TaUGT的拟南芥及小麦幼胚，农杆菌介导的GUS基因瞬时表达能力明显降低。电镜观察结果表明，过表达TaUGT后减少了农杆菌在小麦幼胚细胞表面附着的数量。利用农杆菌介导再次转化过表达TaUGT的烟草植株，转化效率明显降低。利用基因枪介导抑制小麦成熟胚愈伤组织中TaUGT的表达，增加了农杆菌侵染后小麦成熟胚愈伤组织的分化能力，但没有提高最终转化率。此外，体外真核表达的TaUGT并不影响农杆菌的生长。综上所述，很多参与小麦正常代谢途径的基因都与小麦防御农杆菌侵染有关。TaUGT在农杆菌对小麦的侵染阶段，从农杆菌吸附小麦细胞表面到T-DNA转入小麦细胞的过程中调节小麦对农杆菌的防御反应。
【作者】周晓鸿；
【导师】叶兴国；
【作者基本信息】中国农业科学院，作物遗传育种，2014，博士
【关键词】小麦；农杆菌转化；差异表达基因；葡萄糖基转化酶；功能分析；

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