田旋花对草甘膦耐药性分子机制

【摘要】草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，是国内外防除一年生及多年生杂草的主要药剂。草甘膦的作用机制是抑制植物体内5-烯醇式丙酮酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS）的活性，导致莽草酸大量积累，并抑制芳香族氨基酸的生物合成，进而扰乱正常的氮代谢致使植物死亡。田旋花（ConvolvulusarvensisL.）属旋花科，是一种多年生恶性杂草，其繁殖和再生能力极强，是我国小麦、玉米、大豆、棉花等旱作物田的重要杂草，也是对草甘膦具有天然耐药性的杂草之一。本研究以田旋花为对象，以草甘膦的靶标EPSPS为主线，运用分子生物学等技术，研究田旋花对草甘膦的耐药性机制。主要结论如下：1.克隆的田旋花EPSPS基因片段长度为1707bp，将EPSPS基因推导出氨基酸序列与其它14种植物进行比对，结果显示田旋花EPSPS保守性较高，与其它植物相比田旋花在141位为丙氨酸，而其它植物为缬氨酸；此外，田旋花和打碗花在155位为丝氨酸，而其它植物为半胱氨酸。田旋花EPSPS氨基酸序列具有典型的EPSP-synthase结构。2.以田旋花cDNA为模板，合成EPSPS基因并连接到含有35S启动子和GUS基因的pBll21载体上，构建植物超表达载体pBI-EPSPS。采用农杆菌介导法转化拟南芥，共获得15株转EPSPS基因拟南芥。对转EPSPS基因拟南芥进行草甘膦处理发现，转基因拟南芥草甘膦耐受性增强。3.采用实时荧光定量PCR测定了田旋花EPSPS基因在不同叶龄、不同器官的相对表达量以及草甘膦对田旋花EPSPS基因表达的影响。结果表明：田旋花EPSPS基因在不同叶龄表达有差异，在9叶期的表达量最高，是3叶期的2.1倍；EPSPS基因在叶的表达量高于茎、子叶和根；用草甘膦对田旋花进行茎叶喷雾处理，EPSPS基因的表达量先升高后降低，在处理后24小时达最大值。随着草甘膦浓度的提高，EPSPS基因表达呈增强趋势。4.根据已克隆的田旋花EPSPS基因cDNA序列设计三个嵌套引物，通过染色体步移技术获得了1142bp的EPSPS-P启动子片段(GenBank登录号:KC107822)，对启动子序列分析显示该片段富含A/T碱基、TATA-box、CAAT-box及其它顺势作用元件如GATA-motif、TC-richrepeats、spl等。5.将EPSPS-P与GUS报告基因连接构建植物表达载体，利用农杆菌介导法获得转EPSPS-P拟南芥。对转基因拟南芥进行组织化学染色分析表明，EPSPS基因在根、茎、叶中都有表达，表达量的高低顺序是叶中最高，其次是茎和根。对转EPSPS-P拟南芥进行草甘膦处理，组织化学染色和GUS酶活性检测结果表明草甘膦处理可以引起EPSPS基因表达升高。
【作者】黄兆峰；
【导师】张朝贤；
【作者基本信息】中国农业科学院，杂草科学，2014，博士
【关键词】田旋花；EPSPS；基因克隆；启动子；

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