Connexin43、MMP-2和TIMP-2在心室颤动发生维持与转复中的表达变化及作用研究

【摘要】研究背景心室颤动(简称室颤)是心源性猝死最常见的原因。近年来,随着电生理标测技术的进步和对心脏颤动的激动特点研究的深入,对室颤机制的认识有了很大进展,但快速心律失常要维持存在,折返激动仍是其最主要的机制。构成折返环的条件包括：①解剖上客观存在折返环；②单向传导阻滞；③传导速度和不应期的不一致。在这3个基本条件中,可兴奋组织的不应期是由单个细胞的电活动决定的,而单个细胞的兴奋要扩布到相邻的细胞,进而引起整个心肌组织的同步兴奋,则是由细胞间电耦联决定的,而细胞间电耦联通过缝隙连接(gapjunction,GJ)来完成,GJ是组织被动电活动的主要物质基础。细胞间GJ有两种连接方式：端—端(end-to-end)连接和侧—侧(side-to-side)连接,心肌各向异性的结构基础就取决于GJ的连接方式。正常心肌呈梭状排列,长轴方向GJ中端—端连接比例大,结合处阻抗较低,离子电流易于通过,电激动传导速度快,而短轴方向GJ中侧—侧连接比例大,电流通过结合处阻抗较大,电激动传导速度慢,呈“之”字形扩布,激动被分隔而碎裂,出现尖锐错折样传导,易于形成折返。侧—侧传导比例的增加,理论上有助于心律失常的产生及维持。缝隙连接蛋白(connexins,Cx)是构成细胞间GJ的亚单位。Cx表达水平的降低和分布异常,可使心肌整体的传导速度减慢,传导的各向异性改变,从而形成折返环路的解剖学基础,诱发心律失常。在成年心室,GJ仅含有Cx43而且主要分布在闰盘内。我们前期的研究已经证实,心肌Cx43表达减少以及分布和排列紊乱造成的GJ重构参与了室颤的发生与维持,而缝隙连接增强剂ZP123可以通过减少或逆转Cx43的降解并使其分布排列趋于均一,从而降低除颤能量,使室颤易于转复。Cx43属于磷蛋白,GJ通道的功能也受Cx43磷酸化的影响。在心肌细胞,磷酸化的Cx43(p-Cx43)才能构成有功能的GJ,而去磷酸化的Cx43不具备GJ的功能。那么,室颤的发生与转复过程中是否存在Cx43磷酸化水平的改变?Cx43磷酸化水平的改变对于室颤的维持与转复又有着怎样的影响作用?室颤时ZP123对缝隙连接的增强作用是否也包括上调Cx43的磷酸化水平?这些问题在我们前期的研究中未作深入探索,目前也未见相关报道。电活动的均一性传导除了依赖于心肌细胞间的电偶联,还受细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)的影响。正常生理状态下,心脏ECM的合成与降解维持着一动态平衡,其成分的过度生成或异常降解都可能会破坏心肌的力学性质和电生理结构,影响电活动的均一性传导。近年来研究表明,基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)与基质金属蛋白酶组织抑制因子(tissueinhibitomofmetalloproteinases,TIMPs)的调节对ECM的合成与降解起着非常重要的作用,在心肌组织中MMPs与TIMPs存在严格的平衡。这就提示,心肌MMPs/TIMPs比例失调有可能参与了室颤的发生与维持。但是MMPs与TIMPs在室颤的过程中究竟变化如何?对室颤的发生维持及预后又发挥什么样的作用?这些问题都不清楚,都非常值得研究和探索。血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是肾素一血管紧张素系统(renin-angiotensinsystem,RAS)的主要活性成分,既往的研究结果证实其广泛参与了高血压、左室肥厚、心力衰竭等许多心血管疾病的发生和发展。近年来的研究还发现,AngⅡ能够影响左室心肌的各项电生理指标而参与恶性室性心律失常的发生,而传统的降压药物血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)和血管紧张素受体拮抗剂(ARB)则能通过抑制循环与局部心肌组织AngⅡ的生物学效应,减少恶性室性心律失常的发生。目前关于AngⅡ致室性心律失常的具体机制尚不明确,但有研究报道,AngⅡ可以减少Cx43的表达,减慢心肌细胞间的电传导,提示AngⅡ通过引起心肌细胞间的GJ重构而导致心肌电生理的异常。那么,这会不会就是AngII参与室颤维持的蛋白分子机制呢?因此,本研究拟通过建立长时程室颤动物模型,对以上未知的问题进行深入的探讨。目的一、观察心肌细胞膜Cx43的表达、分布及其磷酸化水平在室颤发生维持与转复过程中的动态变化。二、观察心肌MMP-2/TIMP-2在室颤发生维持及转复过程的表达变化,并分析其与室颤预后的关系。三、观察缝隙连接增强剂ZP123在不同室颤时程对Cx43的表达、分布及磷酸化水平的影响作用。四、通过分析ZP123对除颤阈值、除颤成功率、ROSC和存活率等指标的影响,评价其对室颤转复的作用效果。五、探寻AngⅡ参与室性心律失常的蛋白分子机制。方法一、通过建立长时程室颤动物模型,观察心肌Cx43及其磷酸化水平、MMP-2与TIMP-2在室颤发生与维持过程中的动态变化(一)实验动物准备1.随机选取成年家犬32只,雌雄不限。3%戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉静注麻醉,气管插管,连接呼吸机,监测心电图。2.所有动物行经胸超声检查,测量左房内径(LAD)、左室舒张期内径(LVDd)和左室射血分数(LVEF)。3.穿刺股动、静脉,分别将压力导管送入主动脉和右心房,在X线下确定导线位置,并连于多导电生理记录仪,监测与记录主动脉收缩压(AOSP)、主动脉舒张压(AODP)和右房舒张压(RADP)。冠脉灌注压(CPP)=AOPD-RADP,平均动脉压(MAP)=1/3AOSP+2/3AODP。(二)室颤动物模型的建立1.动物随机分为4组：假手术组,8分钟室颤组,12分钟室颤组和30分钟室颤组,每组8只。假手术组只麻醉插管取心肌,不予致颤。2.致颤：将体外电刺激器火线端与零线端的导电针头分别插入心前区左上方与右下方的皮下,以80V持续刺激5s可以成功的诱发持续性室颤。室颤成功的标准：(1)心电图示室颤波形；(2)主动脉压力失去波动(近似一条直线),降至10～20mmHg以下。此时立即撤除呼吸机,模仿临床人类室颤状态。(三)测定Cx43、p-Cx43、MMP-2及TIMP-2在室颤不同时程中的表达水平1.待各组持续相应的室颤时间,将动物用氯化钾处死,迅速开胸沿左心室长轴,留取0.5cm3大小的左心室游离壁心肌组织数块,一部分用4%多聚甲醛固定,另一部分放入液氮中速冻,然后转存至-80℃冰箱冻存。2.分别提取心肌细胞总蛋白及细胞膜蛋白,Westernblot检测心肌细胞膜Cx43、p-Cx43,心肌MMP-2及TIMP-2的表达。3.免疫荧光及激光共聚焦显微镜分析Cx43和p-Cx43的表达和分布。用Image-ProPlus6.0软件分析荧光强度。4.免疫组织化学染色法分析MMP-2与TIMP-2的表达水平。二、观察心肌Cx43、p-Cx43、MMP-2/TIMP-2、AngⅡ在室颤转复过程中的表达变化,以及ZP123对Cx43、p-Cx43表达与分布的影响,评价ZP123对室颤转复的作用效果,同时探寻MMP-2/TIMP-2、AngⅡ与室颤预后的关系(一)实验动物准备1.随机选取家犬48只,雌雄不限。3%戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉静注麻醉,气管插管,连接呼吸机,用体外自动除颤器监测心电图及血氧饱和度(Sa02)。2.超声心动图及血流动力学检测：所有动物在致颤前及自主循环恢复(ROSC)后行经胸超声检查,测量LAD、LVDd和LVEF。穿刺股动、静脉,分别将压力导管送入主动脉和右心房,在X线下确定导线位置,并连于16道多导电生理记录仪,监测并记录AOSP、AODP和RADP。CPP=AOPD-RADP,MAP=1/3AOSP+2/3AODP。(二)室颤动物模型的建立1.实验动物随机分为6组：8分钟室颤ZP123组(8-minVF+ZP123组),8分钟室颤生理盐水对照组(8-minVF+NS组),12分钟室颤ZP123组(12-minVF+ZP123组),12分钟室颤生理盐水对照组(12-minVF+NS组),30分钟室颤ZP123组(30-minVF+ZP123组)和30分钟室颤生理盐水对照组(30-minVF+NS组),每组8只。2.药物应用：3个ZP123组在致颤前给予ZP1231μg/kg静推+10μg·kg-1·h-1溶于50ml生理盐水微量泵泵入30分钟；3个对照组给予生理盐水50ml微量泵泵入30分钟。3.心前区备皮后,将体外电刺激器的导电针头分别插入心前区左上方与右下方的皮下,待各组药物泵完后,立即按下体外电刺激器上的绿色通电按钮,80V,持续5s致颤。(三)心肺复苏及电除颤1.待各组室颤持续相应的时间后,立即开始胸外心脏按压(cardiopulmonaryresuscitation,CPR),同时连接气囊,按压通气比为30：2,通气时不中断按压,通过POWERLAB系统监测压力波形判断和保证按压的效果,频率控制在100-120次/min,放松时胸廓恢复到正常位置,按压／放松时间比大致相等。2.5个复苏周期即2min后,进行脉搏与心律评估,仍为室颤的给予双相波电除颤,若没有达到ROSC,则再按照前述进行下一个2minCPR,如此循环。所有动物首次除颤能量均为70J,第二次则增至100J,第三次增至150J,以后每次除颤均为150J。对于30min内未达到ROSC的动物不再继续复苏,达到ROSC(AOSP≥80mmHg且至少持续1min)的动物立即给予高级生命支持,并观察1小时。3.计算各组平均除颤能量,除颤成功率,ROSC和存活(1小时)率。(四)测定各组Cx43、p-Cx43、MMP-2及TIMP-2的表达1.达到实验终点的动物用氯化钾处死,迅速开胸沿左心室长轴,留取左室游离壁心肌组织。2.Westernblot检测心肌细胞膜Cx43、p-Cx43,心肌MMP-2与TIMP-2的表达水平。3.免疫荧光及激光共聚焦显微镜分析Cx43和p-Cx43的表达和分布。4.免疫组织化学染色法测定MMP-2及TIMP-2的表达。(五)心肌AngⅡ含量的测定1.制备心肌组织匀浆。2.双抗体夹心ELISA法测定心肌组织AngⅡ含量。结果一、Cx43、p-Cx43、MMP-2及TIMP-2在室颤发生与维持过程中的动态变化(一)各组动物基础状态的比较各组动物在体重、心率、LAD、LVDd、LVEF及血流动力学指标等均无统计学差异(P>0.05)(二)Cx43和p-Cx43在心室颤动发生与维持过程中的表达1.免疫荧光染色结果假手术组Cx43和p-Cx43荧光信号强,形态清晰,分布均匀,排列有序；室颤组随着室颤时程的延长,Cx43和p-Cx43荧光信号逐渐减弱,形态模糊,排列紊乱,呈现不均一分布。2.Westernblot分析结果图像定量分析结果显示,与假手术组相比,心肌细胞膜Cx43表达水平随室颤时程延长明显下降(P<0.05)。12分钟室颤组和30分钟室颤组心肌细胞膜p-Cx43表达水平明显减少(P<0.05),而8分钟室颤组与假手术组相比无明显统计学差异,但仍有下降趋势(P>0.05)。3.p-Cx43/Cx43比值随室颤时程延长而不断减小(P<0.05)(三)MMP-2与TIMP-2在心室颤动发生与维持过程中的变化1.免疫组化与Westernblot结果显示,与假手术组相比,室颤组TIMP-2表达水平随室颤时程的延长明显减少(P<0.05)。8分钟室颤组MMP-2表达水平与假手术组无统计学差异(P>0.05),但是在另外两个长时程室颤组(12分钟和30分钟室颤组)MMP-2表达水平明显增加(P<0.05与假手术组比较)。2.室颤组MMP-2/TIMP-2比值较假手术组升高,而且随室颤时程延长逐渐增加(P<0.05)。p-Cx43/Cx43与MMP-2/TIMP-2的比值变化相关分析结果显示,p-Cx43/Cx43与MMP-2/TIMP-2呈显著负相关(r=—0.93,P<0.01)。二、心肌Cx43、p-Cx43、MMP-2/TIMP-2、AngⅡ在室颤转复过程中的表达变化及ZP123的作用(一)各组动物基础状态指标的比较致颤前,各组动物体重、心率、LAD、LVDd、LVEF及血流动力学指标等均无统计学差异(P>0.05)。(二)实验终点各组存活的动物超声与血流动力学指标的比较对各组复苏后恢复自主循环并存活超过1小时的家犬进行超声与血流动力学指标统计分析显示,8分钟室颤、12分钟室颤的ZP123组和NS对照组LAD、LVDd均较室颤前明显增大(P<0.05),而LVEF则较室颤前明显下降(P<0.05),且12分钟室颤ZP123组和NS对照组LAD、LVEF与8分钟室颤的同治疗组相比差异有统计学意义(P<0.05),LVDd值虽然也比8分钟室颤的同治疗组增大,但未达统计学差异,血流动力学指标除RADP与室颤前无显著统计学差异(P>0.05),其余指标AOSP、AODP、MAP及CPP四组均较室颤前明显降低(P<0.05)。30分钟室颤的两个实验组因存活家犬数量过少,未进行统计学分析。(三)实验终点各组动物除颤成功率、平均除颤能量以及存活率的比较8分钟室颤ZP123治疗组8只家犬全部成功除颤,其中有7只在前三次除颤成功复律,且7只全部达到ROSC并存活；8分钟室颤NS对照组有7只获得成功除颤,其中4只在前三次除颤成功复律,共有6只达到ROSC并存活1小时以上。12分钟室颤ZP123治疗组有7只家犬成功除颤,其中5只在前三次除颤中复律并成功达到ROSC,4只存活时间大于1小时；同时程室颤的NS对照组有5只除颤成功,其中2只是在前三次除颤中复律,4只家犬达到了ROSC但仅3只存活超过1小时。30分钟室颤ZP123治疗组有2只家犬获得成功除颤,但均未达到ROSC；同时程NS组有1只除颤成功并存活。统计学分析结果显示,8分钟和12分钟室颤ZP123组前三次除颤成功率均明显高于同时程室颤NS对照组(P<0.05),且所用平均除颤能量显著低于同时程室颤NS对照组(P<0.05)。尽管ZP123用药组的自主循环恢复率和存活率与同室颤时程的NS对照组相比,差异未达到统计学显著性(P>0.05),但8分钟和12分钟室颤ZP123组均较同时程的NS对照组有着相对较高的自主循环恢复率和存活率。(四)用药后各ZP123组与对照组心肌Cx43与p-Cx43的表达变化1.免疫荧光染色结果各ZP123组的Cx43和p-Cx43荧光信号均较同时程室颤生理盐水对照组强,形态更加清晰,分布更加均匀,排列更加有序；且随着室颤时程的延长,ZP123组和对照组Cx43.p-Cx43荧光信号逐渐减弱,形态模糊,排列紊乱,呈现不均一分布。2.Westernblot分析结果图像定量分析结果显示,与假手术组相比,3个ZP123治疗组和3个对照组心肌胞膜Cx43表达水平均明显降低(P<0.05或P<0.01),12分钟室颤和30分钟室颤ZP123治疗组Cx43表达水平高于同时程室颤NS对照组(P<0.05),8分钟室颤ZP123治疗组与NS对照组Cx43表达水平无统计学差异(P>0.05)。随室颤时间的延长,各组心肌细胞膜p-Cx43表达水平逐渐下降,不同时程室颤ZP123治疗组心肌细胞膜p-Cx43表达水平均明显高于同时程室颤NS对照组(P<0.05)。3.p-Cx43/Cx43比值变化p-Cx43/Cx43比值随室颤时程延长逐渐减小,且不同时程室颤ZP123治疗组p-Cx43/Cx43比值高于同时程室颤NS对照组(P<0.05)。(五)治疗组与对照组心肌AngⅡ含量测定结果与假手术组相比较,各ZP123治疗组与NS对照组心肌AngⅡ含量均显著增加(P<0.05或P<0.01),且随室颤时程的延长,心肌AngⅡ含量逐渐升高,但同时程室颤ZP123治疗组与NS对照组相比,心肌AngⅡ含量差异无统计学意义(P>0.05)。(六)不同室颤时程存活组与死亡组心肌MMP-2与TIMP-2表达水平1.免疫组织化学染色与Westernblot结果通过统计学分析,同时程室颤ZP123组与NS对照组相比,心肌MMP-2和TIMP-2的表达均无显著统计学差异(P>0.05)。但是对实验终点时各时程室颤的存活家犬与死亡家犬心肌MMP-2和TIMP-2的表达水平进行统计学分析比较,结果显示,8分钟与12分钟时程室颤存活组心肌MMP-2表达水平较死亡组略高,但差异无显著性(P>0.05),存活组心肌TIMP-2表达水平显著高于同时程室颤死亡组(P<0.05)。30分钟时程室颤组因存活动物过少,未进行统计学分析。2.MMP-2/TIMP-2比值8分钟与12分钟时程室颤存活组MMP-2/TIMP-2比值均明显低于同时程室颤死亡组(P<0.05)(七)不同时程室颤存活组与死亡组心肌AngⅡ含量比较通过对各时程室颤存活家犬与死亡家犬的心肌AngⅡ含量进行比较发现,存活组家犬心肌AngⅡ含量均明显低于同时程室颤死亡组(P<0.05)。30分钟时程室颤组因存活动物过少,未进行统计学分析。(八)各指标的相关性分析相关性分析结果显示,心肌细胞膜Cx43表达水平与除颤成功率呈显著正相关(r=0.91,P<0.01)；心肌细胞膜Cx43表达水平与平均除颤能量呈显著负相关(r=-0.854,P<0.01)；心肌细胞膜磷酸化Cx43表达水平与前三次除颤成功率呈显著正相关(r=0.926,P<0.01)；NS对照组心肌细胞膜Cx43和p-Cx43表达水平均与心肌AngⅡ含量呈显著负相关(r=-0.945、-0.909,P<0.01)；心肌TIMP-2表达水平与心肌AngⅡ含量呈显著负相关(r=-0.947,P<0.01)。结论1.室颤的发生发展过程中,心肌细胞膜Cx43发生了重构,不仅表现为Cx43表达量的减少,排列和分布的紊乱,还包括磷酸化Cx43比例的减少和非磷酸化Cx43比例的增加,并且随着室颤时程的延长,Cx43重构表现得更为明显。缝隙连接增强剂ZP123能通过减轻Cx43重构,包括上调心肌细胞膜Cx43表达,减少去磷酸化,使Cx43排列与分布趋于均一,改善心肌细胞间缝隙连接电耦联,从而降低除颤能量,提高除颤成功率。2.心肌MMPs与TIMPs调节失衡导致的细胞外基质重构参与了室颤的发生与维持,且NMMPs/TIMPs表达失衡与室颤复苏死亡率相关,其作用机制可能是通过引发复苏时心肌缺血再灌注损伤。3.在室颤的发展过程中,缝隙连接重构与细胞外基质重构是伴随发生的。4.AngⅡ既能通过下调Cx43表达,降低Cx43磷酸化水平,引起GJ重构,又能通过破坏MMPs/TIMPs平衡导致心肌缺血再灌注损伤,二者作用的共同结果就是促使室颤更易于维持,不易转复,而且增加复苏后心肌损伤,不利于室颤预后。而ARB降低室性心律失常发生率与死亡率的机制,可能正是因为阻滞了AngⅡ的上述效应。5.预防性应用ARB类药物可能会降低室颤的发生率和死亡率。
【作者】王静；
【导师】钟敬泉；
【作者基本信息】山东大学，内科学，2014，博士
【关键词】心室颤动；缝隙连接蛋白Cx43；基质金属蛋白酶；基质金属蛋白酶抑制剂；ZP123；血管紧张素Ⅱ；

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