宫颈癌组织中RASSF2A基因启动子甲基化状态及其临床意义

【摘要】研究背景：宫颈癌又称宫颈浸润癌,是最常见的妇科恶性肿瘤,严重威胁女性生命健康,发病率和死亡率呈逐年升高的趋势。全世界每年大约有新发病例50万,其中80%以上发生在发展中国家。人乳头状瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌发生的最重要病因,超过90%的宫颈鳞癌和超过50%的宫颈腺癌中可检测到HPVDNA,使得宫颈癌成为目前人类所有恶性肿瘤中唯一病因明确的疾病,但是HPV感染只是引起宫颈病变或宫颈癌的必要但不充分条件,流行病学调查显示,在感染HPV的妇女中,只有极少数发展为宫颈癌,提示还有其他重要因素参与宫颈癌的恶性转化过程。随着社会的不断进步,宫颈癌普查的普及有效筛查方法的建立,更多的人群在出现危险信号初期即可被发现,宫颈癌的发病率和病死率也有了大幅度的降低,但仍居我国妇女恶性肿瘤的第2位,且5年生存率仍不令人满意,在宫颈癌I期>80%,II期50%-60%,III期25%-40%,IV期5%-15%。目前,宫颈癌发生的确切机制尚不完全清楚,宫颈癌的治疗技术仍需进一步提高,因此,寻找宫颈癌发生发展过程中相关的分子生物学指标及治疗的特异性靶分子,是我们急需解决的问题。近些年随着对肿瘤发生的分子生物学机制研究的不断深入,表观遗传学在肿瘤发生中的作用逐渐受到人们的重视。它的主要表现形式有：DNA甲基化,组蛋白修饰,基因组印记,母体效应,RNA编辑等。DNA甲基化是重要的表观遗传学修饰形式,研究表明,抑癌基因启动子区CpG岛的高甲基化是导致抑癌基因失活的一个重要机制。RAS蛋白通过一些重要的信号传导途径,调节细胞的分化、增殖、凋亡等生命活动。研究表明,RAS信号通路的改变可导致肿瘤的发生,近年来一组含有RAS相关结构域的蛋白被命名为RASSF(Rasassociateddomainfamily)家族,是RAS激活信号传导通路中非常重要的负效应调节子。迄今为止,共发现10种RAS相关结构域家族成员,其中有9种在人类肿瘤中低表达或缺失。RASSF2A基因作为一个潜在的抑癌基因,其表达减弱或缺失已见于结肠癌,胃癌,胰腺癌和鼻咽癌等肿瘤。但目前有关RASSF2A基因表达及其启动子区甲基化状态与宫颈癌关系的研究尚未见报道。本实验通过检测宫颈癌组织和细胞中RASSF2A基因启动子甲基化状态及其mRNA表达情况,分析RASSF2A基因启动子异常甲基化与其表达的相关性,及其与年龄、临床分期、组织分级、病理学类型、淋巴转移等临床病理特征的关系。并使用5-aza-dC诱导4种宫颈癌细胞系去甲基化,检测RASSF2A基因mRNA表达水平的改变、甲基化状态的变化以及对其生物学行为的影响,以探讨RASSF2A基因启动子区甲基化在宫颈癌发生发展中的作用。第一部分宫颈癌RASSF2A基因启动子甲基化及其与临床病理特征的关系目的：检测宫颈癌、宫颈上皮内瘤变和正常宫颈组织中RASSF2A启动子甲基化状态及其mRNA的表达情况,分析RASSF2A启动子甲基化与其mRNA表达的相关性,及其与宫颈癌患者年龄、临床分期、组织分级、病理学类型、淋巴转移等特征间的关系,初步探讨RASSF2A启动子甲基化在宫颈癌发生、发展过程中的作用。方法：本研究采用RT-PCR方法检测正常宫颈、宫颈上皮内瘤变和宫颈癌组织中RASSF2AmRNA的表达情况,并运用甲基化特异性PCR(Methylation-specificPCR,MSP)检测以上宫颈组织中RASSF2A启动子的甲基化状态。结果：1.在所有正常宫颈和大部分宫颈上皮内瘤变组织中均检测到RASSF2AmRNA的表达,阳性表达率为100%(25/25)和71%(27/38),而在宫颈癌组织中RASSF2A的表达率明显下降,仅为35%(16/46)。RASSF2AmRNA的表达水平在宫颈癌组中明显低于宫颈上皮内瘤变组(x2=10.96,P<0.01),在宫颈上皮内瘤变组明显低于正常宫颈组(x2=8.77,P<0.01),对照组CINI中的表达明显高于CINII-Ⅲ(x2=9.031,P<0.01),差异具有显著性。2.宫颈癌组织中56.5%(25/46)的组织存在RASSF2A启动子甲基化,宫颈上皮内瘤变组织中仅18.4%(7/38)检测到RASSF2A启动子甲基化,而在正常宫颈组织中却没有检测到甲基化现象。宫颈癌组织RASSF2A基因启动子甲基化阳性率明显高于CIN组及正常宫颈组(x2=12.67,22.30,P<0.01),CIN组明显高于正常宫颈组(x2=5.181,P<0.05),而CINI组中RASSF2A基因甲基化阳性率明显低于CINII-Ⅲ组(x2=5.01,P<0.05),差异具有显著性。3.在宫颈癌中,RASSF2A启动子甲基化阴性的组织其mRNA表达率较高,为57.1%(12/21),而存在启动子甲基化的组织中mRNA表达率仅为16%(4/25),差异具有显著性(x2=8.52,P<0.01)。4.宫颈癌组织RASSF2A启动子甲基化程度与患者年龄、临床分期、组织分级和病理学类型之间无明显关系,但RASSF2A基因启动子甲基化程度与淋巴结转移密切相关(x2=5.828,p<0.05)。结论：1.与正常宫颈及宫颈上皮内瘤变组织相比,RASSF2AmRNA在宫颈癌组织中低表达或表达缺失。2.RASSF2A基因启动子区CpG岛的高甲基化是宫颈癌中的频发事件,它是宫颈癌中RASSF2AmRNA低表达或表达缺失的重要原因。3.宫颈癌中RASSF2A基因的甲基化程度与淋巴结转移密切相关,表明RASSF2A基因甲基化可能与宫颈癌的淋巴结浸润和转移有关,预示较差的临床预后。4.RASSF2A基因的高甲基化可作为宫颈癌的表观遗传学标记物,用于宫颈癌的诊断及预后判断。第二部分宫颈癌细胞系中RASSF2A基因启动子甲基化状态目的：拟通过MSP方法检测4种不同宫颈癌细胞系HeLa,CaSki,SiHa和C33A中RASSF2A启动子区甲基化水平,应用去甲基化药物5-aza-dC作用于细胞系,分析去甲基化前后RASSF2A表达水平、甲基化状态及细胞生物活性的变化,探讨宫颈癌发生的可能机制及治疗策略。方法：本研究采用RT-PCR方法检测去甲基化药物作用前后RASSF2A的表达；MSP法检测4种宫颈癌细胞系中RASSF2A启动子区甲基化状态,免疫细胞化学方法检测RASSF2A蛋白表达的变化,并用MTT和流式细胞术观察对其生物活性的影响。结果：1.宫颈癌细胞系HeLa和SiHa表现为完全甲基化状态(M),其余细胞系CaSki和C33A表现为混合甲基化状态(M+U)。2.去甲基化药物可使宫颈癌细胞系部分去甲基化,并使RASSF2A在宫颈癌细胞中无论mRNA还是蛋白水平均表达显著增高。3.在宫颈癌HeLa细胞的生物学行为检测发现,通过5-aza-dC的诱导作用其增殖能力和抵抗凋亡的能力明显下降。结论：1.宫颈癌细胞系中均检测出RASSF2A启动子区甲基化状态,应用去甲基化药物5-aza-dC可使RASSF2A重新表达或表达升高,说明甲基化是导致宫颈癌细胞中RASSF2A表达缺失或降低的重要原因之一。2.去甲基化药物5-aza-dC能够逆转宫颈癌细胞系RASSF2A基因启动子异常甲基化水平,提高RASSF2A基因的mRNA和蛋白表达水平,提示RASSF2A基因的甲基化水平可以作为评估去甲基化干预是否有效的分子学标志物,为宫颈癌的临床治疗提供新的分子靶点。
【作者】张娴；
【导师】张友忠；
【作者基本信息】山东大学，妇产科学（专业学位），2014，博士
【关键词】宫颈癌；RASSF2A基因；DNA甲基化；甲基化特异性PCR；5-aza-dC；

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