肝星状细胞对肝癌耐药性的影响及机制研究

【摘要】背景和目的化学药物治疗是使用药物直接破坏或杀伤癌细胞，以治疗肿瘤的一种方法。对于肝癌患者而言，主要用于肝癌手术后微残余病灶的清除和不适合手术的中晚期肝癌患者的综合治疗。近些年来，新的化疗药物得到不断研发，抗肿瘤药物治疗得到了迅速的发展，这对提高肝癌患者的治疗效果发挥了一定的作用。然而，化疗过程中众多的不利因素制约了肝癌化疗的效果。除了出现较多的不良反应外，肿瘤细胞对化疗药物产生的耐药性也是制约肿瘤化疗效果的主要原因。因此，针对肿瘤化学耐药性的研究是当前肿瘤研究的热点之一。目前，很多研究者采用“种子”与“土壤”学说来描述肿瘤与其周围微环境之间的相互关联。肿瘤微环境由间质细胞、可溶性细胞因子和细胞外基质蛋白等成分构建，是当前肿瘤研究的新兴领域之一。众多的研究表明肿瘤细胞和它周围的间质细胞通过相互交惠的作用影响肿瘤的生物学行为，包括上皮细胞间质转化、肿瘤干细胞特性的维持、侵袭、转移和化疗抵抗等。在肝癌中，肝星状细胞被认为是构成肿瘤微环境最重要的间质细胞，它通过分泌大量的细胞外基质蛋白、生长因子和细胞因子等影响肝癌细胞的生物学行为。研究已经证实肝星状细胞在肝癌的发生、生长、侵袭和转移中发挥重要的作用。但肝星状细胞对肝癌细胞耐用性的影响尚未明确。肿瘤微环境中炎症，低氧、乏营养和某些细胞因子(如肝细胞生长因子和转化生长因子等)均可以诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化。越来越多的研究证实：1发生上皮细胞间质转化肿瘤细胞具有肿瘤干细胞特性；2它们之间具有类似的信号调节通路；3肿瘤干细胞特性的获得和维持被认为是肿瘤耐药性形成的重要机制之一。因此，本课题旨在分析：1肝星状细胞对肝癌耐药性的影响；2肝星状细胞是否诱导肝癌发生上皮细胞间质转化，并获得肿瘤干细胞特征；3肝星状细胞影响肝癌细胞耐药性的分子机制研究。研究方法及结果第一部分：用肝星状细胞系LX-2和化疗药物处理肝癌细胞Hep3B和SMMC7721，观察肝癌细胞耐药表型的变化。采用MTT实验检测肝癌细胞增殖活性，PI/AnnexinV-FITC双染流式细胞术检测肝癌细胞凋亡率，WesternBlot检测肝癌细胞凋亡蛋白Caspase3和8激活水平。体内试验中，我们在裸鼠皮下接种Hep3B细胞，或者混合接种Hep3B和LX-2细胞，观察它们的成瘤能力及在化疗药物作用下肿瘤的生长情况。实验结果显示肝星状细胞减弱化疗药物的增殖抑制作用和细胞凋亡效应，并通过小鼠动物实验得到验证。第二部分：RealtimePCR和WesternBlot及细胞免疫荧光分析上皮细胞间质转化过程分子标记物E-cadherin和Vimentin的变化，划痕和Transwell实验检测细胞侵袭和转移能力的改变；RealtimePCR和WesternBlot分析肿瘤干细胞相关转录因子BMI1和KLF4的表达，流失细胞术检测CD133的表达，克隆形成实验检测细胞集落形成能力。结果显示：在LX-2CM作用下，E-cadherin的表达下调，Vimentin的表达上调，肿瘤细胞的侵袭和转移能力增强；肝癌细胞BMI1，KLF4和CD133的表达水平及细胞克隆形成能力上调。第三部分：肝星状细胞影响肝癌细胞耐药性的分子机制研究。采用RealtimePCR和ELISA检测肝星状细胞肝细胞生长因子表达情况。我们发现了肝细胞生长因子在肝星状细胞中高表达。WesternBlot分析LX-2CM及采用HGF中和抗体免疫清除HGF后的LX-2CM对肝癌细胞c-Met的活化情况。我们发现LX-2CM上调肝癌细胞c-Met的活化水平，而HGF中和抗体有效拮抗了LX-2CM的作用。最后观察HGF免疫清除前后LX-2CM对诱导肝癌细胞上皮间质转化，获得肿瘤干细胞特征及对肝癌细胞耐药性的效应变化。结果表明应用肝细胞生长因子中和抗体可以有效拮抗LX-2CM诱导的肝癌细胞上皮间质转化、肿瘤干细胞特性和肝癌细胞耐药性的改变。结论肝星状细胞通过合成和分泌HGF，激活肝癌细胞HGF/c-Met信号通路。HGF/c-Met激活通过诱导肝癌细胞发生上皮间质转化，并获得肿瘤干细胞特性，从而增强肝癌细胞对化疗药物的抵抗。
【作者】喻国锋；
【导师】吴孟超；
【作者基本信息】苏州大学，外科学，2014，硕士
【关键词】肝细胞癌；肝星状细胞；肝细胞生长因子；上皮间质转化；肿瘤干细胞；化疗抵抗；

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