CD4+IL9+T细胞在结直肠癌免疫微环境中分布、表型、分化与募集的实验研究

CD4+IL9+T细胞在结直肠癌免疫微环境中分布、表型、分化与募集的实验研究

作者:师大云端图书馆 时间:2015-06-16 分类:期刊论文 喜欢:3391
师大云端图书馆

【摘要】第一部分CD4+IL-9+T细胞在结直肠肿瘤微环境及外周血的分布及临床意义目的检测CD4+IL-9+(Th9)T细胞在结直肠癌免疫微环境中、癌旁及外周血中分布比例,分析其与临床病理的相关性及其与其他CD4+T亚型分布的相关性。方法首先,选取5例结直肠癌患者对其肿瘤和癌旁正常组织中CD4和IL-9的蛋白表达进行免疫荧光鉴定。另选取2013年6月5号至12月10号在广西医科大学第一附属医院结直肠外科初次行手术治疗的45例结直肠癌患者的肿瘤组织、相对应癌旁正常组织和外周血(术前、术后),同时抽取15例健康志愿者外周血,用流式细胞仪检测各标本中CD4+IL-9+T细胞在CD4+T细胞中所占的比例,同时检测这45例患者肿瘤组织Th1、Th2以及Th17细胞的分布比例;记录患者的临床病理资料(性别、年龄、民族、Duke’s分期、肿瘤大小、肿瘤位置、淋巴结转移情况、CEA和AFP水平)。比较CD4+IL-9+T细胞在肿瘤组织、相对应癌旁正常组织以及外周血(术前、术后)、健康人外周血中的分布差异;分析肿瘤组织中CD4+IL-9+T的分布与患者临床病理的相关性;比较肿瘤组织中CD4+IL-9+T的分布与Th1、Th2以及Th17细胞比例的相关性。结果免疫双染色法显示,CD4+IL-9+T细胞表达于结直肠癌肿瘤和癌旁正常组织中;肠癌组织中的CD4+IL-9+T细胞比例(1.12±0.33%)明显高于癌旁正常组织(0.85±0.29%)和术前(0.65±0.27%)、术后(0.47±0.24%)以及健康人外周血(0.43±0.25%),P<0.05;术前外周血CD4+IL-9+T细胞比例明显高于术后外周血和健康人外周血,P<0.05;CD4+IL-9+T细胞与肠癌临床病理相关性分析表明,其与Duke’s分期有关,P<0.05,与患者性别、年龄、民族、肿瘤大小、肿瘤位置、淋巴结是否转移没有明显相关性,P>0.05;Pearson相关性分析显示CD4+IL-9+T细胞的分布特征与CEA不相关(r=-0.46,P=0.810),与患者AFP水平亦不相关(r=0.281,P=0.133);肠癌组织中CD4+IL-9+T细胞比例与Th1细胞无明显相关(r=0.140,P=0.360),与Th2细胞比例成负相关性(r=-0.65,P<0.001),CD4+IL-9+T细胞与Th17细胞比例成正相关性,r=0.367,P=0.013。结论CD4+IL-9+T细胞表达于结直肠癌肿瘤免疫微环境中,且其分布比例高于癌旁和外周血,呈现聚集效应;CD4+IL-9+T细胞的分布比例与结直肠癌Duke’s分期相关,其可能参与了结直肠癌的发生发展。第二部分结直肠癌免疫微环境CD4+IL-9+T细胞表型、相关细胞因子表达及临床意义目的研究结直肠癌肿瘤免疫微环境中CD4+IL-9+T细胞的表型特征,相关细胞因子、转录因子以及趋化因子的表达水平,探讨其与临床病理的相关性。方法采集上述45例经病理确诊的结直肠癌患者肿瘤组织和相应癌旁正常组织,以及外周血(术前及术后),同时抽取同期临床特征相似的15例健康志愿者外周血。运用实时荧光定量PCR技术检测上述组织和外周血中CD4+IL-9+T细胞主要细胞因子IL-9、IL-10和转录因子PU.1、IRF4以及趋化因子CCL2、CCL5、CCL20、CCL22和CCL27的表达;运用液相蛋白芯片技术测定细胞因子IL-9、IL-10在上述组织和外周血中的浓度。另选取10例同期病理证实的结直肠癌患者肿瘤组织标本,运用流式细胞技术对位于肿瘤微环境中CD4+IL-9+T细胞表面的T细胞功能标记(HLA-DR、CD25、PD-1、Foxp3、CD45RO和CD45RA)以及趋化因子受体(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5和CCR6)表达测定。结果结直肠癌肿瘤微环境中的CD4+IL-9+T细胞表面低表达HLA-DR(5.4±2.9%)、CD25(1.7±1.3%),PD-1(4.9±3.2%),Foxp3(2.5±1.6%)和CD45RA分子(2.3±1.8%),而高表达CD45RO分子(83.2±31.5%);CD4+IL-9+T细胞表面低表达CCR1(7.89±3.42%)、CCR3(3.15±1.56%)、CCR4(8.69±4.25%),CCR6(2.56±1.34%)受体,而高表达CCR2(79.53±24.12%),CCR5(72.34±21.69%)受体。RT-PCR检测结果表明,IL-9的基因相对表达量(2.21±1.634)高于相对应的癌旁正常组织(1.38±1.68),亦高于术前、术后外周血及健康人外周血,P<0.05;术前外周血IL-9基因相对表达量高于术后外周血,也高于健康人外周血,P<0.05;细胞因子IL-10在结直肠癌肿瘤微环境中的相对表达量为1.78±0.95,高于相应的癌旁正常组织表达量1.28±0.59,P=0.075,也高于其在患者术前、术后外周血以及健康人外周血中的表达,P<0.05;细胞因子IL-10在患者术前外周血中的相对表达量高于术后和健康人外周血,P<0.05。液相蛋白芯片检测结果显示,细胞因子IL-9在结直肠癌患者微环境中的浓度为0.82±0.65pg/ml,高于癌旁0.59±0.53pg/ml,P=0.0308;同时,它也高于术前、术后及健康人外周血中IL-9的浓度,P<0.05;细胞因子IL-10在结直肠癌患者微环境中的浓度高于癌旁,分别为0.75±0.53和0.56±0.51pg/ml,P<0.05,它也高于术前、术后及健康人外周血中IL-10的浓度,P<0.05。相关性分析显示,结直肠癌患者肿瘤微环境中的细胞因子IL-9的蛋白水平与患者的年龄、性别、民族、淋巴结是否转移、肿瘤部位、肿瘤大小、分化程度没有明显相关性,P>0.05;与肿瘤Duke’s分期存在相关性,P<0.05,分期越高IL-9的蛋白水平越高。细胞因子IL-10与上述临床病理因素无明显病理相关性。RT-PCR结果显示趋化因子CCL5在肿瘤微环境中的表达高于癌旁正常组织,P<0.05,也高于术前、术后外周血及健康人外周血中的表达,P<0.05;CCL2在肿瘤微环境中的表达量比癌旁正常组织低,P<0.05,但与术前、术后外周血及健康人外周血中的表达无明显差异,P>0.05;趋化因子CCL22在在肿瘤微环境的表达高于癌旁、术前与术后外周血、健康外周血中的表达,P<0.05,趋化因子CCL20、CCL-27的表达也具有相似的结论。RT-PCR检测结果显示,PU.1基因在肿瘤组织中表达量(1.12±0.30)高于癌旁正常组织中相对表达量(0.86±0.42),P=0.005;IRF4在肿瘤和癌旁正常组织中的表达量各为0.45±0.11和0.43±0.10,P=0.392,无明显差异。Pearson相关性分析显示PU.1基因表达量与CD4+IL-9+T分布呈现正相关性(r=0.346,P=0.020);Pearson相关性分析显示IRF4基因表达量与CD4+IL-9+T没有明显相关性(r=0.055,P=0.721)。结论结直肠癌肿瘤微环境中的CD4+IL-9+T细胞拥有独特的T细胞功能标记和趋化因子受体表达谱。结直肠癌肿瘤微环境中高表达CD4+IL-9+T细胞主要细胞因子IL-9和IL-10、趋化因子CCL5以及特异性转录因子PU.1。结直肠肿瘤微环境中的CD4+IL-9+T细胞高表达CCR2与CCR5趋化因子受体,高表达的的趋化因子CCL5和受体CCR5相互作用可能是CD4+IL-9+T细胞在结直肠癌免疫微环境中募集的机制之一。第三部分结直肠癌免疫微环境CD4+IL9+T细胞分化、募集机制及IL-9、IL-10对结直肠癌细胞株生长、凋亡与迁移的影响目的探讨结直肠癌免疫微环境中CD4+IL9+T细胞分化、募集机制及细胞因子IL-9、IL-10对肠癌细胞株SW480生长、凋亡、迁移和侵袭的影响方法采用免疫磁珠分选法从结直肠癌肿瘤微环境中阳性分选初始CD4+T细胞,然后单独或联合添加细胞因子IL-4和TGF-β刺激培养,运用流式细胞技术和RT-PCR技术分别检测不同因子刺激后CD4+IL-9+T细胞的比例以及相关细胞因子IL-9、IL-10和转录因子PU.1,IRF4的表达量,比较各细胞因子干预组之间的差异;选取趋化因子CCL2、CCL5、CCL20、CCL22进行趋化试验,观察其对来自结直肠癌免疫微环境中CD4+IL-9+T细胞的招募能力;将细胞因子IL-9和IL-10分别添加至SW480人大肠癌细胞系中培养,通过迁移实验和侵袭实验以及增殖和凋亡实验分析IL-9和IL-10对SW480细胞迁移和侵袭能力以及增殖和凋亡的影响。结果我们采用免疫磁珠阳性分选的方法从结直肠癌癌组织中分选出高纯度的初始CD4+细胞,经流式细胞技术检测阳性率达97.7%;流式细胞技术结果显示,细胞因子IL-9、IL-10联合刺激组对CD4+IL-9细胞的诱导分化能力最强,明显优于空白组、IL-4组,TGF-β组,其诱导刺激后CD4+IL-9+T的比例分别为1.35±0.45%、1.72±0.77%、3.47±1.75%、10.7±2.94%。IL-4组与空白组中CD4+IL-9细胞比例差别无统计学意义,P>0.05,TGF-β组高于IL-4组和空白组,P<0.05。RT-PCR检测结果显示,IL-4和TGF-β联合组诱导下CD4+IL-9+T相关细胞因子IL-9,IL-10和转录因子PU.1、IRF4的表达量较之空白组、IL-4组和TGF-β组均显增高,P<0.05,差异具有统计学意义;TGF-β组诱导下细胞因子IL-9表达高于空白组,P<0.05,其余各组间比较差异无统计学意义。趋化试验结果显示,趋化因子CCL5、CCL22对CD4+IL-9+T细胞具有较强的趋化作用,优于空白组和趋化因子CCL2、CCL20,差异存在统计学意义(P<0.05)。趋化因子CCL2、CCL20对CD4+IL-9+T细胞作用不明显,与空白组相比差异无统计学意义。Transwell迁移和侵袭实验结果显示,细胞因子IL-9干预后能明显增强SW480细胞的侵袭和迁移能力,其作用效果优于IL-10组和空白组;细胞因子IL-10对SW480细胞株的侵袭与迁移作用不明显,与对照组效果相当。流式细胞技术分析结果显示,细胞因子IL-10和IL-9干预均能促进SW480细胞的增殖,增殖率(S/G2期)均比空白对照组显著增高,p<0.05,差异具有统计学意义;IL-9干预组SW480细胞凋亡率明显低于IL-10干预组和空白对照组,P<0.05,差异具有统计学意义;而细胞因子IL-10对SW480细胞凋亡的抑制作用不明显,与对照组凋亡率相当,差异无统计学意义,P>0.05。结论我们的研究进一步证实TGF-β和IL-4可有效促进初始CD4+T细胞向CD4+IL-9+T细胞分化,其诱导分化能力优与单独使用;IL-9可有效的促进SW480细胞迁移和侵袭,并能够促进它的增值且抑制它的凋亡,干预IL-9的信号通路或者降低IL-9的活性或许能够成为治疗结直肠肿瘤的新靶点.
【作者】张磊昌;
【导师】陈利生;
【作者基本信息】广西医科大学,外科学,2014,博士
【关键词】结直肠癌;CD4+IL-9+T细胞;免疫微环境;

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