Th22细胞及IL-22与小鼠病毒性心肌炎关系的初步研究

【摘要】病毒性心肌炎(viralmyocarditis,VMC)是一种病毒感染引起的急性心肌局灶性或弥漫性病变，是临床常见的心血管疾病之一。众多研究已经证实，嗜心性病毒如柯萨奇病毒B3（coxsackievirusB3，CVB3）感染不但可以引起VMC，部分VMC患者可转化为扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy，DCM)，两者是心源性猝死的重要原因。目前认为，病毒的直接攻击和其引发的自身免疫反应在VMC的发病机制中起到重要作用。临床研究及动物实验表明，T辅助细胞（Th）如Th1、Th2、Th17细胞及其效应因子如IFN-γ、IL-12、IL-10、IL-17等在调节VMC免疫及炎症网络方面起重要的作用。然而，VMC发病机制仍未完全阐明，目前临床上针对VMC仍以对症支持治疗为主，因此进一步研究病毒性心肌炎的发病机制有重要意义。Th22细胞是以分泌白介素-22(interleukin-22，IL-22)为特征的一种新发现的独立CD4+T辅助细胞亚群，其不同于传统的Th1、Th2、Th17等细胞亚群。近来研究表明，Th22细胞及其效应因子IL-22参与人或动物多种自身免疫性疾病及感染性疾病的病理生理机制,且其特征性细胞因子IL-22在呼吸道损伤和炎症中促进/抑制炎症的功能由IL-17A调节。然而Th22细胞及其效应因子IL-22是否参与病毒性心肌炎发病过程？在VMC中促进还是抑制心肌炎症发展？IL-l7A是否影响其作用？目前尚未报道。为深入了解Th22细胞及IL-22是否参与VMC发病机制，阐明其在VMC中的作用，寻求VMC新的治疗思路和靶点，本课题拟应用BALB/c小鼠腹腔注射CVB3方法建立VMC模型，进行以下三方面研究。第一部分VMC小鼠Th22细胞及其相关因子的表达本部分包括两个方面的研究：1、小鼠VMC模型的建立以及心肌病理组织学改变；2、小鼠VMCTh22细胞亚群及其相关因子IL-22、IL-22受体（IL-22R）的变化及意义。32只6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为VMC组(n=20)及对照组(n=12)。采用腹腔接种CVB3建立VMC模型（VMC组），对照组腹腔注射等量的磷酸盐缓冲液（PBS），各组小鼠在规定时点取血，分离血浆，无菌取心脏和脾。HE染色了解心肌病理组织学改变并计算心肌病理积分；流式细胞术（FACS）检测小鼠脾Th22细胞；实时荧光定量PCR(realtimeRT-PCR)检测心肌组织Th22细胞相关因子IL-22、IL-22R1（IL-22特异性受体亚基）、IL-10R2mRNA的表达；免疫组织化学检测小鼠心肌组织IL-22表达水平；酶联免疫双夹心抗体法（ELISA）检测血浆中IL-22蛋白的表达。病理结果显示，VMC组小鼠心肌组织病理积分明显升高，与对照组相应时点亚组比较差异有显著性（P<0.05）。流式细胞计数结果显示，对照组Th22细胞表达量为0.84%±0.33%，VMC组明显升高（3.47%±0.66%），差异有统计学意义（P<0.01）。免疫组化结果显示，VMC组心肌组织IL-22较对照组明显升高（236.24±43.26vs.17.45±5.21，P<0.01）。RT-PCR结果显示VMC组心肌组织IL-22、IL-22R1mRNA均较对照组明显升高（21.28±4.28vs.4.28±0.97；3.01±0.78vs.1.05±0.29,P均<0.01）。VMC组心肌组织IL-10R2mRNA较对照组明显降低（43.28±9.14vs.58.5±9.01,P<0.05）。ELISA结果显示，VMC组血浆IL-22蛋白含量较对照组明显升高（20.21±3.81vs.3.02±0.83pg/ml,P<0.01）。结论：Th22细胞及其相关因子IL-22、IL-22R1在VMC组均较对照组增高，提示Th22细胞及其相关因子可能参与小鼠VMC的发病机制。第二部分：抗IL-22抗体对小鼠VMC的干预作用本部分包括三个方面的研究：1、抗IL-22抗体对VMC小鼠心肌病理改变的影响；2、抗IL-22抗体对VMC小鼠IL-22–IL-22R表达的影响；3、抗IL-22抗体对VMC小鼠IL-6、TNF-α、IL-17、IFN-γ、IL-1β表达以及病毒复制的影响。6周龄雄性BABL/c小鼠36只，随机分成3组，抗IL-22抗体组（Anti-IL-22Ab组，n=12）、同型对照组（IgG组，n=12）、PBS组（n=12）。Anti-IL-22Ab、IgG和PBS组小鼠均腹腔注射CVB3病毒液，注射病毒当天定义为第0天。Anti-IL-22Ab、IgG和PBS组小鼠在第0天分别腹腔注射50μgAnti-IL-22Ab、50μg同型对照IgG和50μgPBS。HE染色了解心肌病理改变；RT-PCR检测小鼠心肌组织中IL-22、IL-22R1、IL-10R2、IL-17、TNF-α、CVB3、IL-6、IFN-γ、IL-1βmRNA的表达；ELISA检测小鼠血浆中IL-22、IL-17、TNF-α、IL-6、IFN-γ、IL-1β的表达水平；流式细胞技术检测脾Th22亚群细胞数目；空斑形成法检测心肌病毒滴度。结果显示，Anti-IL-22Ab可增加心脏重量/体重（HW/BW）比值、增多心肌组织内炎性浸润灶、升高心肌病理积分。Anti-IL-22Ab减少Th22细胞及IL-22水平，增加心肌中IL-22R1的含量，升高心肌及血浆中IL-17、IL-6、TNF-α、降低IFN-γ的mRNA及蛋白水平，促进心肌病毒复制。对IL-1β的mRNA及蛋白表达均无明显影响。结论：Th22细胞的重要细胞因子IL-22减少VMC小鼠心肌炎症、抑制病毒复制，发挥保护心肌的重要作用。IL-22可能是治疗VMC的重要靶标。第三部分IL-17A对小鼠病毒性心肌炎中IL-22作用的影响本部分包括两个方面的研究：1.抗IL-22抗体对IL-17A-/-小鼠病毒性心肌炎心肌病理变化的影响；2.抗IL-22抗体对IL-17A-/-小鼠病毒性心肌炎心肌病毒复制，IL-6、TNF-α、IFN-γ及STAT3表达的影响。6周龄SPF级雄性IL-17A基因敲除型(IL-17A-deficient,IL-17A-/-)BALB/c小鼠32只，随机分成4组，抗IL-22抗体组（Anti-IL-22Ab组，n=8）、同型对照组（IgG组，n=8）、病毒性心肌炎组（VMC组，n=8）、正常对照组（Normal组，n=8）。Anti-IL-22Ab、IgG和VMC组小鼠均腹腔注射CVB3病毒液，注射病毒当天定义为第0天。Anti-IL-22Ab、IgG和VMC组小鼠在第0天分别腹腔注射50μgAnti-IL-22Ab、50μg同型对照IgG和50μgPBS。正常对照组（Normal组）未接受任何处理。第14天时，所有小鼠摘眼球取血后处死小鼠。HE染色了解心肌病理改变；记录心脏重量/体重（HW/BW）比值；RT-PCR法测定心肌组织CVB3、TNF-α、IL-6、IFN-γ、STAT3、IL-22的mRNA含量；ELISA检测小鼠血清中IL-22浓度；空斑形成法评估心肌病毒滴度；蛋白质印迹（Western-blot）法检测小鼠心肌组织磷酸化STAT3（p-STAT3）蛋白表达；重组IL-17（rIL-17）培养VMC小鼠脾脏淋巴细胞，RT-PCR法检测淋巴细胞IL-22及IL-6mRNA，ELISA法观察培养上清液IL-22蛋白浓度。结果显示：在IL-17A基因敲除背景下，Anti-IL-22Ab降低VMC的严重程度，降低VMC的HW/BW，加重心肌CVB3病毒复制，减少心肌炎性因子TNF-ɑ、IL-6、IFN-γmRNA含量，降低STAT3mRNA及p-STAT3蛋白表达，降低心肌IL-22mRNA及血清IL-22蛋白水平，且心肌CVB3RNA与IL-22mRNA、CVB3RNA与IFN-γmRNA均呈负相关。同时，体外细胞培养实验证明，重组IL-17（rIL-17）促进VMC小鼠脾脏淋巴细胞合成分泌IL-22及IL-6。结论：在IL-17A基因敲除背景下，IL-22加重心肌炎症，抑制心肌病毒复制。结合第二部分研究内容，提示IL-17A能调节IL-22对VMC心肌组织炎症抑制/促进的功效，但不改变IL-22抑制心肌病毒复制的作用。本课题研究结果提示：VMC小鼠中Th22细胞及其效应因子IL-22、IL-22特异性受体亚基IL-22R1均明显升高，提示Th22细胞及其细胞因子可能参与VMC发病机制；在IL-17A共表达情况下，IL-22降低VMC小鼠心肌组织炎症程度，其作用机制可能主要与抑制病毒复制，抑制炎性因子IL-6、IL-17及TNF-α的水平，促进病毒清除者IFN-γ含量上升有关；在缺乏IL-17A的背景下，IL-22虽仍能抑制病毒复制，但加重VMC心肌炎症，其机制可能与促进炎性因子TNF-ɑ、IL-6、IFN-γ的表达有关，提示在VMC小鼠中，IL-17A不能调节IL-22的抗病毒功效，但可调节IL-22的促炎/抑炎作用。这些数据提示Th22细胞可能参与VMC的发病机制，Th22细胞及其细胞因子IL-22可能将成为病毒性心肌炎新的治疗靶点。
【作者】孔清；
【导师】伍伟锋；
【作者基本信息】广西医科大学，心血管内科，2014，博士
【关键词】Th22细胞；心肌炎；柯萨奇病毒；白介素22；

【参考文献】
[1]魏连启.酚醛树脂纳米复合材料及其在摩阻材料中的应用研究[D].武汉理工大学,材料学,2004,硕士.
[2]刘斌.聊城市政府信息公开研究[D].山东大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[3]秦珍珍.适用于应力测试系统的自供电技术研究[D].中北大学,信号与信息处理,2014,硕士.
[4]JorgeJamyMartinezSanzetenea.基于中小企业‘B2C’模式的合并交易电子商务研究-以玻利维亚为例[D].宁波大学,MasterinBusinessAdministration（专业学位）,2013,硕士.
[5]殷文杰.认知地图的应用研究[D].陕西师范大学,2003.
[6]秦宗川.论我国亲告罪立法标准的确立[D].西南政法大学,刑法学,2012,硕士.
[7]余臻.电力系统远程监控的若干问题研究[D].厦门大学,2008.
[8]杨鹏.高难度复杂井完井井下套管安全评估及其应用研究[D].西安石油大学,机械工程,2011,硕士.
[9]王昊.三星Galaxy系列智能手机的营销策略研究[D].大连理工大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[10]王令朝.别开生面的“蓝牙”技术[J].上海铁道科技.2001(02)
[11]唐翠柳.体育学位论文英文摘要的撰写分析[D].湖南科技大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[12]韩蓓.试论设计管理的实质及其对企业的意义[D].南京艺术学院,设计艺术学,2004,硕士.
[13]姚俊红.城市建筑立体绿化设计及技术研究[D].西安建筑科技大学,建筑技术科学,2013,硕士.
[14]何绪文,房增强,程言君,于妍,罗梦,贾建丽.污染场地修复过程挥发性有机物散逸规律及浓度分布分析[J].环境化学,2015,02:284-292.
[15]陈肖金.房地产企业资本结构与企业价值研究[D].华中师范大学,企业管理,2013,硕士.
[16]马伊民.有效载荷综合测试、检测系统[J].空间电子技术.2002(02)
[17]赵三武.基于单一工资率的劳动力市场城乡一体化测评[D].浙江工商大学,统计学,2013,硕士.
[18]张村峰,卞奇侃,蒋军成.基于“事故树-层次分析法”的高校学生宿舍火灾风险分析[J].中国安全生产科学技术,2011,10:100-105.
[19]张苗苗.基于因子分析的建筑业上市公司收益质量研究[D].长安大学,会计学,2014,硕士.
[20]王力.分布式电网用有源滤波型并网逆变器的研究[D].南京航空航天大学,电机与电器,2013,硕士.
[21]王永丽.聚苯乙烯/石墨烯/Fe_3O_4复合材料的制备及电磁屏蔽性能[D].北京化工大学,2014.
[22]罗磊.575例儿童肝功能损害病因及临床特点研究[D].吉林大学,儿科学,2014,硕士.
[23]聂振娟.武汉市地税局信息管税应用研究[D].华中师范大学,公共管理学,2013,硕士.
[24]郭颖.CRABP2基因在肝癌的表达及对肝癌HCCLM3细胞恶性生物学行为的影响[D].重庆医科大学,肿瘤学,2014,博士.
[25]范国洽.磷酸化p38MAPK在2型糖尿病大鼠大血管中的表达及阿托伐他汀的干预作用[D].河北医科大学,内科学,2014,硕士.
[26]高翔.基于Android平台的飞行游戏的设计与实现[D].华中科技大学,软件工程,2013,硕士.
[27]师帅田.孝道观念对成年子女支持父母的影响[D].华中科技大学,社会学,2013,硕士.
[28]张东红.高危型人乳头瘤病毒感染对食管癌不良预后的研究[D].北京协和医学院,临床检验诊断学,2014,博士.
[29]陆巍,忻健,王翼飞.基于非参数方法的肿瘤基因表达数据挖掘[J].上海大学学报(自然科学版),2003,06:543-548.
[30]王恺伦.关于计算机网络与通信网络技术的发展[J].电子技术与软件工程,2014,20:15.
[31]钟云霞.碳纳米管/棕榈酸复合相变材料传热性能的动力学研究[D].北京化工大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[32]本报记者温宝臣.材料领域的“洗牌者”[N].经济日报,2014-04-09015.
[33]闫磊.中药辨证治疗HAART致血液毒性反应的疗效及安全性评价[D].河南中医学院,中医内科学,2012,硕士.
[34]申红蕾,俞国伟,凌金龙,朱勍.生物法在制备抗癌药物紫杉醇中的应用[J].发酵科技通讯,2013,04:41-44+53.
[35]张一闳.剧场观众厅视觉动力场分析与空间形态设计[D].中国建筑设计研究院,建筑设计及其理论,2014,硕士.
[36]陈美姣.样本选择问题的统计处理研究[D].浙江工商大学,统计学,2013,硕士.
[37]李懋鸣.结冷胶流变行为研究[D].浙江工商大学,食品科学与工程,2013,硕士.
[38]田敏军.WK-10B挖掘机斗杆断裂因素的分析与修复方法的研究[D].辽宁工程技术大学,2005.
[39]金勤可.和谐居住环境研究[D].广东工业大学,环境艺术设计及理论,2013,硕士.
[40]林娟娟.汉英双语词典中附录的优化设计[D].福建师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[41]杨瑞云.罗汉果三萜甙的分离纯化及其变化规律研究[D].广西师范大学,有机化学,2003,硕士.
[42]张清浦.电子政务与GIS[J].大地纵横,2002,Z1:11-15+35.
[43]梁成.南京河西新城区城市管理的绩效评价研究[D].华中科技大学,工商管理,2013,硕士.
[44]刘鑫.动车转向架构架的虚拟制造技术系统研究[D].青岛理工大学,机械工程,2012,硕士.
[45]谭浩广.基于虚拟仪器的风力发电机组故障诊断系统开发与实验研究[D].内蒙古科技大学,机械电子工程,2013,硕士.
[46]薛亚东.基于红外相机的库姆塔格沙漠地区野骆驼活动规律和适宜生境研究[D].中国林业科学研究院,野生动植物保护与利用,2014,博士.
[47]卜一珊.医院药品的现代物流管理研究[D].天津大学,工商管理,2004,硕士.
[48]王素琴.A Task-Based Learning Approach to Intercultural Communication Competence Development for High School Students[D].安徽大学,英语语言文学,2004,硕士.
[49]刘娜.论网络参与对国家政治稳定的影响及应对策略[D].西北大学,政治学理论,2014,硕士.
[50]于博浩.AAO模板法纳米催化材料的合成及FCC汽油改质反应研究[D].辽宁师范大学,2014.