阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞生物活性影响的实验研究

【摘要】第一部分人工关节钛假体表面阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜的制备及表征测试目的：利用真空脉冲磁过滤阴极弧等离子体制备二氧化钛及含氮二氧化钛薄膜，并对其表面特征进行检测。方法：采用真空脉冲磁过滤阴极弧等离子体二氧化钛及含氮二氧化钛薄膜，分别采用纯氧气及氧/氮混合气氛，进行沉积；技术参数为：直流电压40V、负偏压-500V；脉冲占空比15%、脉冲频率7Hz、脉冲宽度2000μs；沉积时间2小时。样品掺氮后，于450℃热处理30min。未掺氮的纯钛片做为空白对照。采用X线光电子能谱对表面元素组成进行分析；测量三组样品的接触角；采用Surpass电位运动分析仪测量三组样品表面的Zeta电位。结果：采用阴极弧等离子体沉积技术未明显改变钛基体的表面形貌，并可成功将氮元素沉积于二氧化钛薄膜表面；纯钛组、二氧化钛组及含氮二氧化钛薄膜组表面的接触角分别为88.1±1.5°、41.5±5.6°及38.4±5.0°；在掺氮后中性或偏碱性的环境下，含氮二氧化钛薄膜表面有更多负电荷。结论：采用真空磁过滤阴极弧等离子体沉积技术，可以成功将氮元素沉积于二氧化钛薄膜中，对钛基体表面的二氧化钛薄膜进行改性。在不影响钛基体表面形态的情况，氮元素的成功的沉积到薄膜中，并改善了钛基体的表面亲水性；在生理pH下使钛基体呈现较多的负电荷。第二部分阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞粘附的影响目的：研究探索阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞粘附的影响。方法：采用阴极弧沉积制备二氧化钛及含氮二氧化钛薄膜；将一定密度的MG63成骨细胞接种于不同样品表面，于2、4、6、12h终止培养，采用CCK-8法定量分析四个时间点MG63细胞在材料表面粘附的数量；于2、6、12h终止培养采用DAPI对三个时间点在材料表面粘附的MG64细胞核进行染色，观察粘附于材料表面细胞数量；于2、6、12、24h终止培养，对四个时间点在材料表面粘附的MG64细胞进行鬼笔环肽及DAPI双染，动态观察MG63细胞形态及细胞骨架蛋白的变化；扫描电镜观察24h成骨细胞在不同样品表面的形态；接种细胞后培养24h，用移液管枪头划伤细胞层，继续培养24h，采用鬼笔环肽及DAPI双染，观察细胞在不同样品表面的迁移。采用定量RT-PCR检测2、6、12、24hMG63成骨细胞Integrin-β1基因表达水平；结果：4、6、12h，含氮二氧化钛薄膜表面粘附的MG63细胞明显多于其他两组，差异有统计学意义；动态细胞形态及骨架蛋白观察显示，含氮二氧化钛表面的成骨细胞较早表达细胞骨架蛋白；扫描电镜显示含氮二氧化钛薄膜的MG63细胞，更加平坦，且细胞铺展面积大；含氮二氧化钛薄膜表面有较多MG63细胞迁徙至划伤区域的中心；在培养12h后，二氧化钛组及含氮二氧化钛薄膜表面MG63细胞Integrin-β1基因表达较纯钛组增加明显，但二氧化钛组与含氮二氧化钛薄膜间无明显差异；结论：含氮二氧化钛薄膜能够明显的促进成骨细胞的粘附及迁移。其可能机制是生理pH下使薄膜表面负电荷增多，通过粘附相关蛋白吸附及构象的改变，促进了成骨细胞表面整合素的结合，进而促进了成骨细胞的粘附和迁移，表面阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜可以增加其生物活性。第三部分阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞增殖的影响目的：研究探索阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞增殖的影响。方法：采用阴极弧沉积制备二氧化钛及含氮二氧化钛薄膜；将一定密度的MG63成骨细胞接种于不同样品表面，采用CCK-8定量分析1、4、7天MG63细胞在不同样品表面增殖数量；通过吖啶橙对1、4、7天三组样品表面的MG63细胞进行染色，观察成骨细胞的增殖情况；流式细胞仪分析1、4、7天成骨细胞在不同样品表面细胞周期情况。结果：培养4天后，含氮二氧化钛薄膜表面的细胞增殖活性高于纯钛组；培养7天时，含氮二氧化钛薄膜表面细胞数量多于纯钛组及二氧化钛组。吖啶橙染色结果与CCK-8结果一致；在培养4天时，含氮二氧化钛薄膜表面的MG63细胞G0/G1的百分比明显低于其余两组，而S期及G2/M期的比例明显升高。结论：阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜能够促进成骨细胞的增殖，可能的机制是掺氮使二氧化钛在生理pH下呈负电位，增加或改变吸附蛋白的性质，促进了成骨细胞的增殖；调节增殖的机制可能与加速细胞周期中S期、G2/M期有关。第四部分阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞分化的影响目的：研究探索阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜对成骨细胞分化的影响。方法：采用阴极弧沉积制备二氧化钛及含氮二氧化钛薄膜；将一定密度的MG63成骨细胞接种于不同样品表面，于1、4、7天收集样本，检测碱性磷酸酶的活性；采用定量RT-PCR检测1、4、7成骨细胞分化标志物碱性磷酸酶、I型胶原基因的表达情况；采用免疫荧光染色对7、10天骨桥蛋白进行染色，同时采用Western-blot检测骨桥蛋白的表达情况。结果：培养至4、7天，含氮二氧化钛薄膜及二氧化钛表面的成骨细胞碱性磷酸酶表达较纯钛组明显增高，但含氮二氧化钛薄膜与二氧化钛组成骨细胞碱性磷酸酶无统计学差异；培养4天后，含氮二氧化钛薄膜表面的MG63成骨细胞碱性磷酸酶基因表达高于纯钛组及二氧化钛组；培养7天后，只有含氮二氧化钛薄膜与纯钛组之间MG63成骨细胞的碱性磷酸酶基因表达量有显著差异；培养4天后，含氮二氧化钛薄膜表面的MG63成骨细胞I型胶原基因表达高于纯钛组及二氧化钛组，含氮二氧化钛薄膜虽高于二氧化钛组，但无统计学差异；培养7天后，三组样品表面MG63细胞I型胶原的表达量都明显增加，含氮二氧化钛薄膜明显高于其余两组；培养7天时三组的骨桥蛋白表达量少；至第10天，OPN的表达增多，含氮二氧化钛薄膜表面MG63成骨细胞骨桥蛋白表达高于纯钛组及二氧化钛组，免疫荧光染色与Western-blot结果基本一致；结论：含氮二氧化钛薄膜不仅能促进MG63细胞早期成骨分化标志物的表达水平，同时也提高了中晚期分化及矿化相关标志的表达水平，表明阴极弧沉积含氮二氧化钛薄膜能够促进成骨细胞的分化及矿化。
【作者】董圣杰；
【导师】孙俊英；
【作者基本信息】苏州大学，骨外科学，2014，博士
【关键词】阴极弧沉积；氮元素；二氧化钛；表征；成骨细胞；粘附；增殖；分化；

【参考文献】
[1]马忠孝.基于GMA的液压高速开关阀结构设计与研究[D].兰州理工大学,机械电子工程,2013,硕士.
[2]马俊杰.雷帕霉素联合顺铂治疗人骨肉瘤细胞的实验研究[D].郑州大学,外科学,2013,硕士.
[3]贾毅.青岛城市足球联赛开展现状及对策研究[D].山东体育学院,运动训练,2012,硕士.
[4]霍振辉.成人骨性Ⅱ类上气道及舌骨形态位置的CBCT研究[D].第四军医大学,口腔临床医学,2014,硕士.
[5]杨晶.氧化锌基复合氧化物光催化剂的研究进展[J].广西师范学院学报(自然科学版),2014,01:46-49.
[6]张桂桂.秦汉时期出行风俗研究[D].兰州大学,中国古代史,2013,硕士.
[7]杜梦乡.《小孙屠》词汇研究[D].四川外国语大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[8]石广勋.基于ZigBee技术的嵌入式智能家居系统的研究与设计[D].中原工学院,控制理论与控制工程,2012,硕士.
[9]吴义霞.小学教师课程观调查研究[D].南京师范大学,课程与教学论,2012,硕士.
[10]徐超.基于颗粒流法的饱和砂层隧道围岩稳定性研究[D].广东工业大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[11]丁东宇.中国传统道德思维方式内在构成及转换研究[D].东北师范大学,马克思主义理论与思想政治教育,2003,硕士.
[12]叶展1,何东平1,2,胡传荣1,2,罗质1,2,亚森·玉山3.菜籽油磷脂酶C脱胶与水化脱胶条件优化及效果对比研究[J].食品工业科技.
[13]谭斌.基于DSP的异步电机SVPWM矢量控制系统研究与实现[D].长安大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[14]李国杰,张丹,姬希娜,周恋花.变电站子站设备通信协议一致性测试系统的开发(一)设计与应用[J].电力系统自动化,2006,15:26-29.
[15]张程.华夏银行深圳分行员工工作压力与离职倾向关系研究[D].天津大学,工商管理,2013,硕士.
[16]刘迎.新世纪以来新闻评论特色研究[D].渤海大学,新闻学,2013,硕士.
[17]李彦.电子商务环境下用户数据的安全管理研究[D].山东师范大学,工商管理（专业学位）,2012,硕士.
[18]王彬.基于无线虚拟社区的精确广告模式研究[D].大连大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[19]方银锋.模块化机器人系统与智能化步态设计[D].浙江工业大学,模式识别与智能系统,2012,硕士.
[20]吴刚,韩崇昭,闫小喜,连峰.基于熵分布的概率假设密度滤波器高斯混合实现[J].控制与决策,2014,01:89-93.
[21]顾珊珊,胡晓君,黄凯.退火温度对硼掺杂纳米金刚石薄膜微结构和p型导电性能的影响[J].物理学报,2013,11:512-521.
[22]熊程刚.直升机旋翼—起落架系统动力学特性分析研究[D].南京航空航天大学,飞行器设计,2013,硕士.
[23]范德营.红外视频图像彩色迁移及目标识别的技术研究[D].华东交通大学,应用数学,2014,硕士.
[24]潘学萍,鞠平,吴峰,金宇清.双馈风电机组模型结构讨论[J].电力系统自动化,2015,05:7-14.
[25]罗维.多普勒计程仪的信号处理算法研究与系统软件设计[D].杭州电子科技大学,通信与信息系统,2014,硕士.
[26]吕冰.磁通门传感器与误差修正技术[D].中国舰船研究院,检测技术与自动化装置,2014,硕士.
[27]杜鑫星.所得税改革对企业债务融资水平的影响研究[D].浙江工商大学,会计学,2014,硕士.
[28]段龙龙.就业结构、经济趋同与收入分配差距研究：基于中国三大区域省际面板数据的实证分析[D].西南交通大学,区域经济学,2013,硕士.
[29]张学洋.基于适配体和抗体功能化纳米材料的疾病标记蛋白质分离分析新方法研究[D].复旦大学,分析化学,2013,博士.
[30]王晓丽.三维斑点追踪技术评价慢性心力衰竭患者左心室心肌应变的临床价值[D].苏州大学,心血管内科（专业学位）,2014,硕士.
[31]许丽.铜基纳米阵列的合成及电化学性能研究[D].北京化工大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[32]沈睿芳,王道平,杨吉江.敏捷供应链知识网络演化模型及知识扩散仿真[J].控制与决策,2014,11:2094-2100.
[33]张创峰.流苏花化学成分的分离与鉴定[D].河南科技大学,有机化学,2013,硕士.
[34]葛鑫.基于创新人才培养下的大学精神文化建设研究[D].曲阜师范大学,思想政治教育,2013,硕士.
[35]宋志超.基于MCF51JM128的汽车行驶记录仪设计[D].西安电子科技大学,电路与系统,2012,硕士.
[36]张畅.罗西尼咏叹调《残酷命运》中女中音花腔技巧研究[D].武汉音乐学院,音乐与舞蹈学,2013,硕士.
[37]徐晓,万跃华.虚拟图书馆信息搜集、组织方式及研究方向[J].情报杂志,2004,05:16-17+20.
[38]林程芳.对比锁阳与锁阳淫羊藿合剂对训练大鼠肝脏的保护作用[D].曲阜师范大学,运动人体科学,2013,硕士.
[39]张强.基于专利计量的专利实施许可实证研究[D].西南政法大学,知识产权法学（专业学位）,2012,硕士.
[40]戴显坚.某展会特装布展施工项目管理研究[D].广东工业大学,工商管理,2013,硕士.
[41]陈金邓.高中数学建模对学生发展促进作用的调查研究[D].首都师范大学,学科教学,2013,硕士.
[42]杨治平.公司治理结构中的多重委托—代理关系分析[D].湖南大学,政治经济学,2003,硕士.
[43]孙文江.自适应神经—模糊推理系统在隧道结构安全评估中的应用[D].浙江大学,桥梁与隧道工程,2013,硕士.
[44]李隽,高艺.2014年国际大电网会议学术动态系列报道电力系统发展和经济性最新进展[J].电力系统自动化,2015,04:1-3+25.
[45]陈雪梅.家蚕核型多角体病毒ORF79基因（bm79）的结构和蛋白互作分析[D].西南大学,细胞生物学,2013,硕士.
[46]高文秀,王洪磊,李慎敏.分子动力学模拟研究纳米碳管中甲醇-水混合溶液的结构与输运性质[J].物理化学学报,2014,09:1625-1633.
[47]杨宇.联合应用DCE-MRI、DWI、PWI诊断乳腺良恶性病变[D].大连医科大学,影像医学与核医学,2012,硕士.
[48]毛景文,HollySTEIN,杜安道,周涛发,梅燕雄,李永峰,藏文栓,李进文.长江中下游地区铜金(钼)矿Re-Os年龄测定及其对成矿作用的指示[J].地质学报,2004,01:121-131.
[49]朱旺喜,邱竹贤,姚广春,赵杰三,张德,杨晓璐.半石墨化阴极碳块推广中的几个问题[J].轻金属.1992(06)
[50]李淼.不同形貌CeO_2的制备及其在乙醇水蒸气重整反应中的应用[D].内蒙古工业大学,化学工程与技术,2013,硕士.