基于金纳米材料的生物传感新方法研究

【摘要】光学生物传感技术通常是指是利用待测物与识别单元结合过程中产生的光学信号,通过换能器将信号转换与放大处理,直接转换成可读的数据,而待测物的定性或定量分析则可由最终输出的数据直接读取或者换算实现。光学生物传感技术无需分离、操作简便可原位实时活体测定,越来越受到人们的关注。纳米材料,泛指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1-100nm)或者由该尺度范围的物质为基本结构单元所构成的具有特殊效应的纳米级物质。纳米材料因其特殊的结构组成常具有其他一般材料所不具备的特殊性质,包括光学性、导热性、导电性、磁性等等。处于原子簇和宏观物体交界的过渡区域的纳米颗粒材料更是具有量子尺寸效应、微小尺寸效应、表面效应、量子隧道效应、介电限域效应等。纳米材料已经广泛应用于电子、化工、轻工、纺织、军事、医学等领域。纳米材料与光学生物传感技术相结合在蛋白小分子作用、医学临床诊断、药物筛选、靶向治疗等方面的研究和应用更是极为重要和急需的。本论文以此为前提,将蛋白、磷脂肌醇酶、蛋白转录后修饰酶、毒素等与人类肿瘤及重大疾病等相关的重要生物功能标志物作为研究对象,发展了一系列简单快捷、低成本、高通量、线性范围宽、稳定性好,且高灵敏、高选择性的新型生物传感方法。本研究论文的主要内容概括如下：(1)磷酸肌醇酶的功能紊乱与已知的肿瘤、糖尿病等多种疾病有着密切的关系,其可逆调节磷酸化磷酸肌醇信号检测在分子机制的理解和治疗诊断工具的开发方面具有的强大的意义。第2章,发展了一种新颖的基于酶调控金纳米颗粒自组装均相比色传感方法用于检测磷酸肌醇激酶和去磷酸酶的活性。根据酶改性磷酸酰肌醇的首基达到结合普列克底物同源性细胞质蛋白或膜蛋白的胞质结构域(PH)的目的。支持磷脂膜包覆金纳米颗粒表面被设计提供了膜蛋白的胞质结构域(PH)的底物基质,有效的提高了酶反应效率。在靶标磷酸肌醇的存在下,支持磷脂膜修饰的金纳米颗粒与磷脂酰肌醇结合蛋白的PH结构域修饰的金纳米颗粒形成自组装交联聚合物,引起金纳米颗粒的表面等离子耦合共振效应,引发紫外吸收光谱值的变化,实现对磷酸肌醇信号的快速灵敏、均相高通量的检测。(2)霍乱弧菌所致的霍乱能导致感染者严重腹泻是流行广泛且古老的烈性传染病,而霍乱毒素(CT)是霍乱弧菌所产生的外毒素,监测霍乱毒素(CT)含量对霍乱的预防、控制工作具有极其重要的意义。人类C反应蛋白(CRP)是与人体内突发性的炎症、或细菌感染、又或者组织损伤、心血管系统疾病(包括冠心病在内)等与发炎相关疾病的指标因子,对于它的评估有着非同寻常的意义。第3章,在前章工作的基础上改进了金纳米颗粒上磷脂膜的修饰方法,使得基于鞘糖脂修饰金纳米颗粒作为可视化生物传感平台用于检测霍乱毒素B亚组分(CTB)及人类C反应蛋白(CRP)更加可靠、灵敏、方便及快速。在此生物传感器的设计上,首先利用带疏水长链烷基的阳离子表面活性剂分子(CTAB)的NH3基端,以Au-NH3键共价作用直接在合成中修饰在金纳米颗粒的表面,紧接着加入鞘糖脂分子。由于鞘糖脂分子含有疏水性的N-脂酰鞘氨醇,它能在合成过程中以范德华(疏水)作用力直接插入到表面活性剂分子(CTAB)的十六烷基疏水链中,在金纳米颗粒表面形成鞘糖脂单分子层,达到将金纳米颗粒表面鞘糖脂功能活化的目的。这种鞘糖脂功能化活性的金纳米颗粒复合物不仅制备过程简单、易操作,而且还具有很好的通用性。利用不同的鞘糖脂及其受体(如霍乱毒素B亚组分(CTB)、人类C反应蛋白(CRP)、破伤风毒素和p糖苷酶等)之间强大的结合力,可以轻松地达到准确定量分析检测毒素及蛋白酶的目的。(3)PTM酶活性的识别和定量对于细胞调控机制的研究、诊断学的发展以及疾病的治疗来说都是非常急待解决的问题,发展一个简单快捷、可自由标记并能实时监测PTM酶的方法是一个艰巨的挑战。第4章,构建了一个简单的,以多肽为模板直接快速合成高产率荧光AuNCs的方法,并且研究了PTM酶的转录后修饰对AuNCs的光化学特性的影响。以组蛋白去乙酰化酶(HDAC1)和蛋白激酶A(PKA)这两种PTM酶作为模型系统。HDAC1和PKA都被认为是与细胞周期调控、细胞增殖和癌症的发展紧密相连的,是最有潜力的治疗靶点与诊断的生物标志物。研究中,首次发现了多肽—AuNC的纳米复合材料,在保持底物肽活性的同时,AuNCs会在底物肽的酶活性修饰中发生荧光淬灭现象。这种酶响应荧光纳米簇的信号指示开辟了直接检测JPTMs转录后修饰无标记方法的可能,建立了一个简单且有用的生物传感平台,可用于灵敏的、实时的检钡PTMs酶。PTMs酶在生命体中占有十分重要的地位,它们的发展可能会催化带动AuNCs在新的生物医学应用、生物过程以及疾病的诊断和治疗的等领域的理解应用。(4)MDM2癌基因,参予细胞的基本生理过程,它的突变与扩增与肿瘤(比如胶质瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤甚至乳腺癌细胞系)的转移密切相关,是一种与多种肿瘤相关的克隆新基因。gp120表面蛋白,是一种病毒外层的糖蛋白,它对于艾滋病毒进入宿主细胞引起病毒感染等方面至关重要。第5章,在前章工作基础上,提出了一个基于蛋白保护生物活性分子的生物传感分析方法用于小分子结合蛋白的研究。理论上,羧基肽酶Y可以将生物多肽链水解成氨基酸小片段,可是,当生物多肽链与其靶向蛋白绑定结合后,靶向蛋白阻止了羧基肽酶Y的水解作用保证了生物多肽链的完整性。本生物传感平台基于此原理,结合以多肽为模板合成金纳米簇的方法发展出一种新型的靶向研究蛋白及小分子作用的方法。这种方法较之传统的的研究方法不同,无需对生物多肽链或靶向蛋白进行前处理。基于蛋白质保护的多肽模板金纳米簇为研究小分子及其结合蛋白特异性相互作用提供一个新的超灵敏生物传感平台。
【作者】文茜；
【导师】蒋健晖；
【作者基本信息】湖南大学，分析化学，2014，博士
【关键词】表面等离子体共振耦合；支持磷脂膜；纳米粒子自组装；磷脂肌醇信号；光学生物传感器；比色分析法；转录后修饰蛋白；均相分析方法；荧光金纳米簇；蛋白保护法；

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