MiR-29对PRRSV在PAM中复制的影响及其靶基因验证

【摘要】猪繁殖与呼吸综合征（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome,PRRS）是目前养猪行业中最为严重的传染病之一，具有高致病性和高死亡率等特点，在感染猪群中能引起严重的繁殖障碍和呼吸性疾病，每年都给全世界养猪行业造成极大的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征的病原体是PRRSV，PRRSV是一种RNA病毒，其基因组有着广泛的遗传变异性，并且具有免疫抑制性，能够逃脱宿主的免疫机制。基于miRNA在宿主-病毒相互作用中的重要作用，本研究挑选在PRRSV感染过程中差异表达的miR-29作为研究对象，探讨miR-29对PRRSV在PAM中复制的影响，为揭示PRRSV感染机制和机体抗PRRSV免疫机制提供理论基础。本研究主要包括：1.PRRSV感染PAM对miR-29的表达量的影响使用0.8MOI、1.0MOI、1.2MOI三个剂量PRRSV感染新分离的PAM，在感染后0h、6h、12h、24h、36h、48h六个时间点定量检测miR-29相对表达量。结果显示miR-29amRNA表达量在PRRSV感染后6h上调不显著，12h、24h、36h、48h均有极显著差异。miR-29b-1mRNA表达量趋势和miR-29a几乎一致，而miR-29c在PAM中不表达或者表达量较低，不能被荧光定量识别。2.miR-29a/b对PRRSV复制的影响鉴于PAM作为不繁殖细胞群不能进行传代和难以转染小分子的特点，本研究构建了pre-miR-29重组慢病毒颗粒。首先使用慢病毒感染PAM，等miR-29表达稳定后感染PRRSV，然后使用绝对定量检测PRRSV复制情况。结果显示miR-29a在感染后24小时之前均能显著性促进PRRSV在PAM中的复制，miR-29b-1过表达作用与miR-29a相似。同时，miR-29a过表达能够抑制AKT3、TP53INP1和RPS6KB1三个基因的表达量。3.miR-29a靶基因验证将AKT3、RPS6KB1两个个基因3’UTR和PRRSV基因组中含有miR-29a种子序列结合位点的片段插入双荧光素酶报告基因载体psiCHECK-2中，其中AKT3基因3’UTR包括两个作用位点，同时突变miR-29a种子区序列结合位点构建突变体报告基因载体。然后我们把pre-miR-29a重组慢病毒、空白慢病毒和psiCHECK-2WT/MT重组质粒共同转染Marc-145细胞，检测相对荧光水平。结果显示，miR-29a可以直接作用于AKT3基因3’UTR抑制其表达，并且对AKT3基因3’UTR的两个位点均有识别作用。另外，miR-29a不能直接作用于PRRSV基因组和RPS6KB1基因3’UTR。
【作者】李传民；
【导师】孙博兴；
【作者基本信息】吉林大学，动物遗传育种与繁殖，2014，硕士
【关键词】miR-29；PAM；PRRSV；靶基因；

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