IL-1β在真菌性角膜炎中的表达和调控机制研究

【摘要】目的：探讨炎症因子白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)在真菌性角膜炎中的表达及其分子调控机制。方法：采用基质内注射法建立小鼠真菌性角膜炎模型,以此作为大体水平的研究对象；获取小鼠骨髓中性粒细胞,以此作为细胞水平的研究对象。实验分为四部分：(1)建立C57BL/6小鼠真菌性角膜炎模型,采用流式细胞术和激光共聚焦显微镜观察IL-1β在角膜组织的表达,探索真菌性角膜炎时IL-1β的主要细胞来源；(2)获取C57BL/6、TLR4-/-以及TRIF-/-小鼠中性粒细胞,与烟曲霉菌株共同培养,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和Western-blot法检测IL-1β的表达,探索真菌性角膜炎时经典Signal1通路对IL-1β的调控作用；(3)建立C57BL/6、NLRP3-/-、ASC-/-以及Caspase-1-/-小鼠真菌性角膜炎模型,获取C57BL/6、Dectin-1-/-、NLRP3-/-、ASC-/-以及Caspase-1-/-小鼠中性粒细胞,与烟曲霉菌共同培养,采用ELISA和Western-blot法检测IL-1β的表达,探索真菌性角膜炎时经典Signal2通路对IL-1β的调控作用；(4)建立C57BL/6、Caspase-1-/-小鼠真菌性角膜炎模型,获取C57BL/6.TLR4-/-、TRIF-/-、Dectin-1-/-以及Caspase-1-/-小鼠中性粒细胞,与烟曲霉菌共同培养,采用Western-blot法检测IL-1β、Caspase-11和Caspase-1的表达,探索真菌性角膜炎时Caspase-11对IL-1β的调控作用。结果：(1)C57BL/6小鼠感染烟曲霉菌24h后,可见大量募集至角膜感染区域的中性粒细胞；所有能够表达IL-1β的细胞中,92.2%的是中性粒细胞；中性粒细胞中能够表达IL-1β的比例为85.4%。感染烟曲霉菌48h后,角膜区域出现较高比例的巨噬细胞；所有能够表达IL-1β的细胞中,29.7%的是巨噬细胞；巨噬细胞中能够表达IL-1β的比例为96.6%。(2)Signal1通路预激活后给予真菌刺激,C57BL/6小鼠中性粒细胞中pro-IL-1β的表达量明显增加,未预激活而只单纯给予真菌刺激,pro-IL-1β的表达量也明显增加,但与有预激相比其增加幅度略少；TLR4-1/-或TRIF-/-小鼠的中性粒细胞被真菌刺激4h或18h后,pro-IL-1β的表达较未感染时明显增多,但是与C57BL/6小鼠相比无明显差异。(3)Dectin-1-/–小鼠或者给予sky阻断剂的C57BL/6小鼠的中性粒细胞被真菌刺激4h后,pro-IL-1β的表达较C57BL/6小鼠明显减少；建立C57BL/6、NLRP3-/-、ASC-/-以及Caspase-1-/-小鼠真菌性角膜炎模型24h后,C57BL/6、NLRP3-/-和ASC-/-小鼠角膜中pro-IL-1β和matureIL-1β的表达量无明显差异,Caspase-1-/-小鼠角膜中pro-IL-1β的表达量无明显差异,但是matureIL-1β的表达量明显低于C57BL/6小鼠；NLRP3-/-和ASC-/-小鼠的中性粒细胞被真菌刺激4h后,pro-IL-1β和matureIL-1β的表达量与C57BL/6小鼠相比无明显差异；Caspase-1-/-小鼠或者给予Caspase-1阻断剂的C57BL/6小鼠的中性粒细胞被真菌刺激4h后,pro-IL-1β的表达量无明显差异,但matureIL-1β的表达量明显低于C57BL/6小鼠。(4)预先给予Caspase-11阻断剂的C57BL/6小鼠真菌性角膜炎模型,建模24h后其角膜中pro-IL-1β的表达量无明显差异,但是matureIL-1β的表达量明显低于未给予阻断剂的C57BL/6小鼠；给予Caspase-11阻断剂的C57BL/6小鼠的中性粒细胞被真菌刺激4h后,pro-IL-1β的表达量无明显差异,但matureIL-1β和matureCaspase-1的表达量明显低于单纯刺激组；随着真菌刺激时间的延长,C57BL/6小鼠中性粒细胞内Caspase-11的表达量逐渐增加；TLR4-/-以及TRIF-/-小鼠中性粒细胞被真菌刺激4h后,Caspase-11的表达量与C57BL/6小鼠无明显差异；Dectin-1-/-小鼠中性粒细胞被真菌刺激4h后,pro-Caspase-11的表达量略少于C57BL/6小鼠,给予syk阻断剂后C57BL/6小鼠中性粒细胞内pro-Caspase-11的表达明显低于未给予阻断剂者。结论：(1)IL-1β参与角膜抗真菌感染的固有免疫过程,中性粒细胞是该阶段主要的细胞来源；(2)真菌感染引起IL-1β的生成可以不通过经典Signal1通路的预激,TLR4/TRIF通路不参与pro-IL-1β的生成；(3)真菌感染时Dectin-1/syk通路参与IL-1β的生成,Caspase-1参与IL-1β由前体至成熟体的修饰,但炎性复合体NLRP3与ASC不参与IL-1β的生成；(4)Caspase-11通过调控Caspase-1由前体至成熟体的修饰过程进而参与IL-1β的生成。
【作者】车成业；
【导师】赵桂秋；
【作者基本信息】青岛大学，眼科学，2014，博士
【关键词】真菌性角膜炎；白介素-1β；小鼠；蛋白表达；信号通路；

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