孤儿受体RORγ的配体小分子的发现

【摘要】维甲酸受体相关孤儿受体RORγ是一类受配体调控的重要转录因子，在Th17细胞分泌IL-17等一系列促炎因子过程中扮演着重要的角色。通过抑制Th17活性，下调IL-17的表达，调节Th17细胞与Treg细胞的平衡，从而减少炎症反应的发生，这使得RORγ成为一个非常具有研究价值的药物靶点。针对RORγ开展药物发现研究有望为治疗类风湿性关节炎、多发性硬化症等自身免疫相关疾病找到新的突破。由于RORγ在疾病发展过程中的重要性，其配体的发现一直广受关注。但到目前为止，还未有针对RORγ的上市药物。针对当前研究现状，我们开展了针对该孤儿受体为靶标的药物发现与设计研究，本课题主要进行的工作分以下几个方面：一、使用计算机辅助药物设计方法进行先导化合物的筛选首先针对现有的小分子化合物库（约30万个），使用基于蛋白结构的分子对接方法筛选。通过此方法挑选出可能作为目的蛋白配体的24个结构不同的小分子化合物并购买，用于活性测试。二、目的蛋白RORγ-LBD（Ligandbindingdomain）表达与纯化本课题采用原核表达方法：大肠埃希氏菌BL21（DE3）大量表达目的蛋白，再对菌株进行高压破碎处理，然后通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析等蛋白纯化方法，获得高纯度目的蛋白。三、小分子化合物抑制活性的测试本课题使用AlphaScreen高通量筛选法和Luciferase双报告基因检测法等较为成熟的测活方法，从通过虚拟筛选得到的24个小分子化合物中找到了一个表现最为良好的化合物S4（AlphaScreenIC50=13.83μM，LuciferaseIC50=11.84μM）。以S4为先导化合物，对其进行修饰改造获得一系列结构相似的小分子化合物（约120个，由本组薛晓纤同学完成），采用同样方法测试抑制活性，有四个化合物表现较为突出。这四个化合物分别命名为Cmpd1，Cmpd2，Cmpd3，Cmpd4。其中Cmpd1（AlphaScreenIC50=3.83μM，LuciferaseIC50=0.14μM）和Cmpd4（AlphaScreenIC50=5.88μM，LuciferaseIC50=0.09μM）的IC50值接近或优于报道过的阳性化合物T1317的IC50值（AlphaScreenIC50=2.01μM，LuciferaseIC50=0.53μM）。四、蛋白质的结晶实验本课题通过使用本实验组晶体筛选条件，采用坐滴法对目的蛋白和筛选出的小分子化合物进行复合物的共结晶，目的是得到复合物晶体。但由于此蛋白结构的性质独特，暂未得到符合X射线衍射标准的蛋白质晶体。因此，我们尝试通过蛋白热稳定实验（TSA）来分析目的蛋白的热稳定性及蛋白结晶条件。目前已取得一定的实验依据，为今后的结晶工作提供了宝贵的实验依据。综上，本课题已成功获得了阳性化合物Digoxin和UA的衍射数据；同时成功地通过计算机辅助设计筛选获得了有效的先导化合物。在此基础上对先导化合物的进一步修饰改造，得到了抑制效果更好的小分子化合物；通过分子模拟方法获得的化合物与RORγ的结合模式预测和分析，获得了重要的构效关系信息。该研究为今后针对RORγ的药物筛选提供了有效的实验依据。
【作者】金翔宇；
【导师】颜炜群；许永；
【作者基本信息】吉林大学，生物医学工程，2014，硕士
【关键词】维甲酸受体相关孤儿受体；药物设计；蛋白质结晶；

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