柔嫩艾美耳球虫微线蛋白与宿主表皮生长因子受体相互作用的研究

【摘要】鸡球虫病是严重危害养鸡业的一种寄生虫病，世界各地普遍发生，其中，以柔嫩艾美耳球虫（E.tenella)致病力最强，危害最为严重。寄生虫与宿主蛋白之间的相互作用是疾病发生、发展的物质基础，但球虫入侵靶细胞的过程尚未明确。因此深入研究入侵宿主细胞早期阶段虫体—宿主之间的相互作用，对阐明寄生虫侵入宿主细胞的机制具有重要意义。微线体是顶复门原虫分泌器官中最小的一个，其分泌的微线蛋白(micronemeprotein,MIC)在顶复门寄生虫入侵过程中起到重要作用。目前，在GeneBank中可获得5种柔嫩艾美耳球虫微线蛋白基因序列，分别为EtMIC1,EtMIC2,EtMIC3,EtMIC4,EtMIC5。其中，EtMIC4具有31个串联的EGF-like结构域，而EGF是表皮生长因子受体的配体之一。表皮生长因子受体（epidermalgrowthfactorreceptor,EGFR）)是一种广泛分布于人及动物各组织细胞膜上的多功能糖蛋白，属受体酪氨酸激酶(RTKs)家族，通过与其特异性配体（如EGF等）结合而被激活，进而招募下游细胞信号分子完成细胞信号从膜外向膜内的转导过程，精确调节细胞增殖、凋亡、迁移、存活等一系列复杂的生理过程。柔嫩艾美耳球虫微线蛋白EGF-like结构域能否结合表皮生长因子受体还有待探究。本研究拟通过酵母双杂交系统初步鉴定EtMIC4中EGF-like结构域与鸡表皮表皮生长因子受体(chickenepidermalgrowthfactorreceptor,CER)间是否存在相互作用；再通过免疫共沉淀及GSTpulldown进一步验证两种蛋白相互作用。EGF-like与CER相互作用的鉴定本研究首先通过RT-PCR扩增EGF-like基因片段及CER基因片段，然后构建诱饵质粒pGBKT7-EGF-like，猎物质粒pGADT7-CER，将诱饵质粒与猎物质粒共转化酵母细胞AH109中，鉴定蛋白的相互作用。结果表明，重组诱饵质粒pGBKT7-EGF-like与猎物质粒pGADT7-CER均构建成功，EtMIC基因可在酵母细胞中表达，且不存在自激活作用。通过GAL4酵母双杂交报告基因lacZ鉴定，EGF-like蛋白与CER蛋白存在相互作用。EGF-like与CER蛋白相互作用的验证构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-myc/his-CER和pcDNA3.1-HA-EGF-like，然后共转染293T细胞，免疫共沉淀验证EGF-like与CER的相互作用。对EGF-like进行原核表达及纯化，通过GSTpulldown试验验证EGF-like与CER蛋白的相互作用。结果表明，免疫共沉淀试验及GSTpulldown均验证EGF-like与CER存在相互作用。上述试验结果为阐明球虫入侵机制、寻找抗球虫药物和疫苗的靶位奠定基础，对鸡球虫病的防治具有重要意义。
【作者】杨拓；
【导师】李建华；
【作者基本信息】吉林大学，预防兽医学，2014，硕士
【关键词】柔嫩艾美耳球虫；EGF-like；CER基因；蛋白相互作用；

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