溶葡萄球菌酶高效裂解细菌细胞壁的机制研究

【摘要】金黄色葡萄球菌(金葡菌)是人类主要的病原菌,它能引起肺炎、骨髓炎、心内膜炎及败血症等多种感染性疾病。随着各种广谱抗菌药物在临床的大量不合理使用,导致金葡菌对抗生素高度耐药,造成临床治疗上的困难及病死率增高,严重威胁人类健康。因此,在合理使用抗生素的同时,也迫切需要开发与传统抗生素作用模式不同的新型抗菌药物。溶葡萄球菌酶是一种由模仿葡萄球菌分泌的肽聚糖水解酶,能高效裂解金葡菌细胞壁。目前,它作为新型抗菌剂已进入临床研究用于治疗创面金葡菌感染。该酶由两个结构域组成：N-端催化结构域(催化区)和X-端细胞壁结合结构域(结合区)。在蛋白结构数据库(PDB)中,目前只有上述两个结构域同源类似物的晶体结构,即LytM(金葡菌分泌的一种自溶酶)的催化区(PDB:2B13)和ALE-1(头状葡萄球菌分泌的一种肽聚糖水解酶)的结合区(PDB:1R77),它们与溶葡萄球菌酶的催化区和结合区分别具有63%和89%的相似性。然而,至今还未见溶葡萄球菌酶晶体结构的报道。为了研究溶葡萄球菌酶如何高效裂解细菌细胞壁肽聚糖,我们展开了系列研究。首先,分别表达和纯化溶葡萄球菌酶及其两个结构域,并且检测了它们的生物活性,发现单独催化区在低盐浓度下具有很强的溶菌活性,但其活性随离子强度的上升而显著下降,当环境中NaCl浓度提高至50mM时,它的溶菌活性只有原来的1%；然而全长溶葡萄球菌酶的溶菌活性受离子强度的干扰非常小；单独结合区具有与金葡菌非常强的亲和力,与催化区不同的是,即使在生理盐浓度(150mMNaCl)下,结合区还保持很强的亲和力,说明结合区和催化区的组合可以显著提高溶葡萄球菌酶的溶菌活性,并耐受环境(比如盐离子)的影响。为进一步了解两个结构域是如何组合在一起发挥高效溶菌活性,我们用同源模建的方法,构建了溶葡萄球菌酶催化区和结合区的三维结构模型,并通过蛋白-蛋白分子对接方法,计算预测溶葡萄球菌酶两个结构域之间的对接方式,发现在自由能最低的前20个结构中,溶葡萄球菌酶两个结构域之间没有特定的相互作用界面,催化区随机分布在结合区的各个方位,说明计算方法并不适合预测溶葡萄球菌酶两个结构域之间对接模型。随后,我们用实验的方法鉴定溶葡萄球菌酶两个结构域之间的相互作用界面,应用氢氘交换质谱法比较全长溶葡萄球菌酶和它两个结构域之间氢氘交换率的变化,发现了4个肽段(aa.331-339、248-260、454-473和474-488)的氢氘交换率在全长溶葡萄球菌酶中变慢,表明这些肽段可能参与溶葡萄球菌酶两个结构域之间相互作用界面的形成。为了验证哪些肽段确实参与界面的形成,我们通过位点特异二硫键交联方法分析肽段之间的交联反应,发现有两个双半胱氨酸突变体(K332C/T464C和K336C/T464C)能够很好的形成二硫键,它们的突变位点分别位于肽段331-339(催化区)和肽段454-473(结合区)上,证明这两个肽段在全长溶葡萄球菌酶分子中紧靠在一起,说明溶葡萄球菌酶的两个结构域在溶液中通过这两个肽段相互作用形成了结构域之间的界面,此时催化区和结合区的活性中心处于同一个平面,有利于它们同时与底物结合。为了研究二硫键的形成对突变体(结构域之间受到限制)生物活性产生的影响,我们比较了突变体(K332C/T464C)和野生型溶葡萄球菌酶与金葡菌细胞壁的亲和力以及它们的溶菌活性。发现结构受限的突变体与金葡菌细胞壁的亲和力没有改变,然而溶菌活性显著下降,尤其是在高盐环境下。为了确认是二硫键产生的影响,我们用DTT打开突变体分子中的二硫键,消除两个结构域之间的限制,发现它的溶菌活性又完全恢复,提示溶葡萄球菌酶两个结构域之间在一定范围内可以相对运动是该酶高效裂解细菌细胞壁的一个重要因素。之前研究人员已经证明肽聚糖是一个具有弹性的网状结构,在不同离子强度条件下可以收缩或者伸展。当环境盐浓度升高,细菌细胞壁收缩,肽聚糖变得松散和无规则,溶葡萄球菌酶两个结构域之间的动力学特点可以帮助催化区迅速调整位置,结合并水解细胞壁上的底物,从而实现高效裂解细菌细胞壁。本研究有助于我们更好地理解溶葡萄球菌酶高效裂解细菌细胞壁的作用机制。根据获得的结构信息,进一步可以选择合适的位点进行聚乙二醇修饰,获得具有良好体内药效学和药代动力学性质的聚乙二醇化溶葡萄球菌酶,从而扩大临床应用范围和提高疗效。
【作者】陆海荣；
【导师】吕红；
【作者基本信息】复旦大学，遗传学，2013，博士
【关键词】溶葡萄球菌酶；金黄色葡萄球菌；抗菌机制；结构模建；氢氘交换；位点特异二硫键交联；

【参考文献】
[1]刘桐桐.基于混沌弱信号检测技术的轴承异常微弱信号辨识[D].内蒙古科技大学,机械电子工程,2013,硕士.
[2]张雨溪.《诗经·国风》与《英格兰和苏格兰民谣》音乐特色比较研究[D].郑州大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[3]从友忠.高等学校跨学科教育的理论与机制研究[D].大连理工大学,高等教育学,2004,硕士.
[4]董玉林.餐厨垃圾与秸秆联合发酵产沼气工艺研究[D].北京化工大学,粮食、油脂及植物蛋白工程,2013,硕士.
[5]张乾一.不同冲动性水平大学生的工作记忆和转换能力及其关系研究[D].广西师范大学,发展与教育心理学,2013,硕士.
[6]赵灵智,胡社军,李伟善,何琴玉,陈俊芳,汝强.吸波材料的吸波原理及其研究进展[J].现代防御技术,2007,01:27-31+48.
[7]石畅.数据校正技术及在MES中的应用[D].浙江大学,控制工程（专业学位）,2013,硕士.
[8]吕子光.虚拟仪器ICO的设计与实现[D].东北大学,计算机系统结构,2010,硕士.
[9]费敏锐.双级计算机控制和管理系统在热处理炉中的应用[J].冶金自动化,1993,04:45-46.
[10]孔德龙.提高化学镀铜溶液稳定性与沉积速率的研究[D].哈尔滨工业大学,化学工程与技术,2013,硕士.
[11]冯星煜.皮带通廊输煤栈桥设计浅析[D].西安建筑科技大学,建筑与土木工程,2013,硕士.
[12]杨京梅.民事诉讼当事人收集证据制度研究[D].中国政法大学,诉讼法学,2014,硕士.
[13]吴亚东.论我国民事诉讼认证制度的完善[D].华中师范大学,法律,2013,硕士.
[14]王忠,席建祥,姚志成,刘光斌.时变概率随机拓扑条件下高阶群系统一致性分析[J].控制与决策,2014,07:1153-1159.
[15]单晋婷.农业GAP系统中的卫星地图土地分割及融合算法[D].湖南师范大学,电路与系统,2013,硕士.
[16]许良,高自友.基于路段能力可靠性的城市交通网络设计[J].中国公路学报,2006,02:86-90.
[17]赵海辉.Ba_(3-x-y)Mg_(0.9)Si_2O_8：Eu_x~(2+)，Tb_y~(3+)，Mn_(0.1)~(2+)红色荧光粉的制备与发光性质研究[D].东北师范大学,材料物理与化学,2012,硕士.
[18]王伯平,景大英.基于遗传算法的配合尺寸公差优化设计[J].农业机械学报.2004(04)
[19]朱庆春.片外存储器的加密与完整性保护研究[D].华中科技大学,半导体芯片系统设计与工艺,2013,硕士.
[20]梁承美.基于物联网的湖泊水质监测系统的研究[D].华东理工大学,机械电子工程,2014,硕士.
[21]王靖.HG公司研发项目管理研究[D].河北工业大学,工商管理,2013,硕士.
[22]郭林娟.用于TNT蒸气检测的荧光纳米纤维膜制备及传感性能研究[D].大连大学,物理化学,2014,硕士.
[23]张枫瑶.当代大学生国防意识培育研究[D].南昌航空大学,思想政治教育,2012,硕士.
[24]张守锐.财务共享服务中心在我国企业中的运用研究[D].苏州大学,会计（专业学位）,2014,硕士.
[25]张莎莎.2002年-2012年台湾报纸报道中的中国大陆政治形象[D].厦门大学,传播学,2014,硕士.
[26]刘方.沈阳市社区老年人卫生服务研究[D].沈阳师范大学,社会保障,2013,硕士.
[27]姜春雨.轻量级VoIP系统中核心节点的研究与实现[D].北京邮电大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[28]刘艳超.商业银行操作风险研究[D].河北大学,金融学,2014,硕士.
[29]李喆.航天测控卫星通信网网络管理技术研究与实现[D].西安电子科技大学,计算机工程,2008,硕士.
[30]颜菲.试论白居易的女性观[D].湘潭大学,中国古代文学,2003,硕士.
[31]和敬涵,孙军昌,姜久春,丁金凤.基于院(系)党政共同负责制的班子合力提升思考[J].中国校外教育,2014,36:32-33.
[32]孙会娟.中学物理教育中发展性学生评价研究[D].首都师范大学,2003.
[33]孙向飞.粗糙集理论在电力系统中应用研究初探[D].昆明理工大学,2003.
[34]温书涛.电子束熔炼提纯多晶硅中热量传输和能量利用的研究[D].大连理工大学,材料学,2013,硕士.
[35]贾立霞.人造血管水渗透仪的设计及其渗透性表征的实验研究[D].东华大学,纺织工程,2004,硕士.
[36]鞠维权.SBS改性沥青混凝土路面技术研究[D].大连理工大学,土木工程,2003,硕士.
[37]张洁.基于工作任务的项目教学在高职课程中的应用研究[D].河北师范大学,教育技术学,2012,硕士.
[38]唐远洋,黄尔嘉.知识挖掘技术与网络教育资源的组织[J].电化教育研究,2003,06:53-55.
[39]郑红伟.物理教学中培养高中生自主探究能力的研究[D].东北师范大学,教育,2012,硕士.
[40]何超.二芳基甲烷羰基化及生物活性分子的合成研究[D].重庆大学,化学,2014,硕士.
[41]王加志.保心降压康对高血压大鼠血浆AngⅡ及ALD水平影响的实验研究[D].黑龙江中医药大学,中医临床基础,2004,硕士.
[42]邢丹丹.瑕疵股权转让的效力[D].郑州大学,民商法学,2013,硕士.
[43]吴铭宇.猝发式直扩系统载波同步技术研究与实现[D].杭州电子科技大学,通信与信息系统,2013,硕士.
[44]李媛.糖尿病慢性皮肤溃疡阴证模型建立与回阳生肌膏对糖尿病阴证溃疡创面不同时相的影响[D].北京中医药大学,中医外科学,2014,硕士.
[45]李淼.义务教育阶段学生化学定量认识水平发展研究[D].首都师范大学,学科教学,2014,硕士.
[46]王旭.基于AdaBoost算法的目标检测系统研究[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2012,硕士.
[47]赵丽华.收获和贮存时间对玉米秸秆营养物质产量和营养价值的影响[D].中国农业大学,动物营养与饲料科学,2004,硕士.
[48]王明洋.滨河风光带人文景观设计研究[D].新疆农业大学,园林植物与观赏园艺,2012,硕士.
[49]曹育红.数据挖掘在e-Learning中的应用[J].机电工程技术,2004,07:38-39.
[50]甘文彪,周洲,许晓平.仿生全翼式太阳能无人机气动数值模拟研究[J].航空学报.