趋化因子CCL28在母—胎界面的表达及其调节作用

【摘要】趋化因子是一类由67-127个氨基酸组成的细胞因子,通过与受体结合发挥多种生物学作用。一种趋化因子可以和一个或多个受体结合,一种趋化因子受体也可有多个趋化因子作为配体。通过配受体相互作用,构成了人体内复杂的趋化因子网络,共同执行着复杂的生物学功能。对趋化因子的功能的研究最初开始于炎症；随研究深入,人们发现趋化因子不仅具有趋化白细胞向炎症局部游走的作用,还参与机体发育,肿瘤发生及进展等过程。我们课题组已经解析了CXCL12/CXCR4、CXCL16/CXCR6和CCL2/CCR2在母-胎界面的生物学功能,及参与母-胎免疫调节的机制。基于母-胎界面可作为特化的粘膜局部,我们在此选择了上皮性趋化因子CCL28及其受体CCR10,研究其在母-胎界面和母-胎免疫调节中的作用。第一部分CCL28在人早孕母-胎界面的表达及调控目的分析证实母-胎界面存在CCL28及其调控。方法收集人早孕期绒毛和蜕膜组织,采用免疫组织化学方法检测CCL28在早孕母-胎界面的表达。分离培养蜕膜基质细胞、蜕膜腺上皮细胞和滋养细胞,采用细胞免疫化学方法检测CCL28的表达。采用RT-PCR、In-cellwestern和流式细胞术进一步证实CCL28在蜕膜基质细胞的表达。对原代培养的蜕膜基质细胞,用促炎性细胞因子或雌、孕激素处理,研究这些因素对CCL28表达的调控作用。结果早孕绒毛和蜕膜组织均能检测到CCL28的表达。原代培养的蜕膜基质细胞、蜕膜腺上皮细胞和滋养细胞均表达CCL28。RT-PCR和In-cellwestern进一步证实了CCL28在蜕膜基质细胞的表达,流式细胞术结果显示90%以上的蜕膜基质细胞表达CCL28。促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ和IL-17A上调CCL28的表达。雌激素和孕激素对CCL28的表达无影响。结论母-胎界面可表达CCL28,促炎性细胞因子上调CCL28在蜕膜基质细胞的表达。第二部分CCL28对蜕膜基质细胞生物学行为的调节作用目的检测蜕膜基质细胞CCL28受体CCR10和CCR3的表达,解析其对蜕膜基质细胞生物学行为的调节作用。方法流式细胞术分析来自正常早孕和不明原因复发性流产的蜕膜基质细胞的CCR10和CCR3的表达。CCK8法研究CCL28对蜕膜基质细胞增殖和活力的影响,侵袭实验检测CCL28对蜕膜基质细胞侵袭能力的影响,AnnexinV和PI染色后流式分析CCL28对蜕膜基质细胞凋亡的作用。细胞因子处理蜕膜基质细胞后,流式细胞术分析CCR10和CCR3在蜕膜基质细胞的表达。ELISA比较正常和不明原因复发性流产的蜕膜基质细胞的IL-1β、TNF-α和IL-17A的分泌。结果不明原因复发性流产蜕膜基质细胞的IL-1β、TNF-α和IL-17A的分泌水平高于正常蜕膜基质细胞。不明原因复发性流产蜕膜基质细胞的CCR10和CCR3的表达均高于正常蜕膜基质细胞。CCL28对蜕膜基质细胞的增殖和活力无影响；通过其受体CCR10和CCR3促进蜕膜基质细胞的侵袭,CCL28主要通过CCR3受体促进DSC的凋亡。IL-1β、TNF-α和IL-17A上调蜕膜基质细胞的CCR10表达,IL-1β和IL-17A都能上调蜕膜基质细胞CCR3的表达。结论自然流产蜕膜基质细胞的CCR10和CCR3的表达上调,增加了其对CCL28的敏感性。CCL28通过CCR10和CCR3促进蜕膜基质细胞的侵袭,通过CCR3诱导蜕膜基质细胞凋亡。不明原因复发性流产蜕膜的蜕膜基质细胞的IL-1β、TNF-α和IL-17A的分泌水平高于正常蜕膜基质细胞。促炎性细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-17A促进蜕膜基质细胞的CCR10表达。IL-1p和TNF-α上调蜕膜基质细胞的CCR3的表达。第三部分人早孕蜕膜CCR10+Treg功能表型目的分析人早孕蜕膜CCR10+Treg表型。方法流式细胞术检测外周和蜕膜局部CCR10+Treg的存在。比较分析正常蜕膜和复发性流产蜕膜的CCR10+Treg百分比。流式细胞术比较分析蜕膜CCR10+Treg和CCR10Treg的表型。结果外周和蜕膜均存在CCR10Treg,占总Treg10%左右。自然流产的CCR10Treg占总Treg的百分比增加。与CCR10Treg比较,CCR10Treg高表达CTLA4、TGF-β1、IL-10、CD45RA、CCR7、CXCR3、CXCR6、CD103、CD29和aVβ5,低表达CXCR4。蜕膜CCR10+Treg的Foxp3的表达低于CCR10Treg。结论蜕膜存在CCR10+Treg,自然流产的蜕膜CCR10+Treg比例升高。与CCR10Treg相比,CCR10+Treg具备独特的表型特征：CTLA4、TGF-β1、IL-10、CD45RA、CCR7、CXCR7、CXCR6、CD103、CD29和αVβ5高表达,CXCR4和Foxp3低表达。第四部分CCL28对CCR10+Treg的募集和调节作用目的探讨CCL28对Treg的趋化作用,SDF-1对CCR10+Treg的趋化能力及CCL28对Treg的Foxp3、CCR10和CCR3的表达调节。方法流式细胞术检测并比较外周和蜕膜Treg的趋化因子受体表达谱。趋化实验分析CCL28对Treg的募集能力,SDF-1对CCR10+Treg的趋化能力。体外分离并扩增Treg,采用rhCCL28进行处理,流式细胞术分析Foxp3、CCR10、CCR3、CD39和CTLA4的表达。结果除了CCR10和CCR3,外周Treg和蜕膜Treg还高表达CCR4、CXCR4和CXCR6,蜕膜Treg的CCR5、CCR6、CCR9、CXCR1、CXCR2和CXCR3的表达水平高于外周Treg。CCL28具备趋化募集Treg的能力,SDF-1募集Treg,以募集CCR10Treg为主。CCL28降调节Treg的Foxp3的表达,促进Treg的CCR10和CCR3的表达；对CD39和CTLA4的表达无明显影响。结论蜕膜Treg可表达多种趋化因子受体,CCL28可募集Treg细胞,SDF-1募集CCR10Treg,CCL28降低Treg的Foxp3表达,促进Treg的CCR10和CCR3表达。
【作者】孙婵；
【导师】李大金；
【作者基本信息】复旦大学，妇产科学，2013，博士
【关键词】CCL28；CCR10；蜕膜基质细胞；调节性T细胞；趋化；侵袭；增殖；凋亡；

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