一种新的可视化环介导等温扩增技术检测疟原虫的研究及其应用评价

【摘要】疟疾是由疟原虫引起的严重危害人民健康和生命的重大传染病，被列为全球三大公共卫生问题之一。疟疾也曾是严重危害我国人民身体健康和影响社会经济的重要传染病。在上世纪60年代和70年代初，我国中部地区曾两次暴发大范围的疟疾流行，在2000年前后，中部地区再次出现了间日疟疫情回升和局部暴发流行。在长期的不懈努力下，我国的疟疾防治工作取得了巨大成绩，上世纪90年代在中国中部地区已成功消除了恶性疟，到2009年，我国已有效控制了间日疟疫情回升和局部暴发流行，疟疾发病率已降至历史最低水平。我国从2010年开始实施《中国消除疟疾行动计划》。消除疟疾阶段的目标、策略和措施与控制阶段有很大的不同。在疟疾控制阶段，控制的目标是降低疟疾发病率，而在消除疟疾阶段，消除的目标是没有本地感染的疟疾病例，因此，及时和准确发现每一个可能的传染源是阻断疟疾传播的关键。《消除疟疾指导手册》在消除疟疾阶段要求对所有疑似病例进行疟疾实验室检测。但随着疟疾发病率的降低，临床患者血液中原虫密度呈下降趋势，低原虫密度临床疟疾的比例逐年上升，给疟疾的实验室诊断带来了新的挑战。传统的血涂片镜检是疟疾实验室诊断最常见的方法，但是镜检的敏感性和准确性依赖于镜检人员的技术和经验，且对低原虫密度检测敏感性不高。新发展的疟疾快速诊断技术（RDTs）具有简单和快速的优点，但现有RDTs对低原虫密度感染的检出率，尤其是对间日疟原虫的检测敏感性常较低。巢式PCR等基因检测技术具有高敏感性、高特异性的优点，然而其需要特殊仪器和试剂，不仅价格较昂贵，且操作步骤较复杂，目前尚需要在有条件的中心实验室开展检测。环介导等温扩增技术（LAMP）是一种新的基因检测技术，具有高敏感性、高特异性和操作简便的优势。在具有链置换功能的BstDNA聚合酶存在下，经过一个恒温扩增的步骤即可完成，能在短时间内实现109-1010的扩增，并产生一种焦磷酸镁衍生物，使反应液呈现肉眼可见的白色浑浊，从而可以根据反应液浑浊与否判定结果。在LAMP反应体系中加入钙黄绿素和核酸染料SYBRGreenI可提高观察效果。但钙黄绿素敏感性不足，SYBRGreenI对扩增反应有抑制作用，需要在反应后加入，然而由于LAMP的高效性，导致反应后开盖存在扩增产物污染的极大风险。为解决上述问题，本实验室研发的一种针对间日疟原虫的可肉眼观察结果的LAMP检测方法，在扩增前加入含有SYBRGreenI染料微晶蜡丸，并在反应完成后可通过加热融化释放染料，使反应产物染色并为肉眼所见。同时蜡丸在试管表面重新凝固形成屏障，可以防止反应产物的污染。但该可视化LAMP技术只能检测间日疟原虫感染，检测的稳定性也有待进一步提高。考虑到目前我国主要存在的除本地感染间日疟病例外，外出务工人员感染输入性恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的病例也正在逐年增加，且绝大多数的疟疾病例都发生在贫困的偏远地区，迫切需要发展一种能同时检测四种疟原虫，稳定、敏感、特异、操作简便、成本低廉且能够进行大规模检测的新技术以用于疟原虫的检测。本研究在已有的可视化LAMP的基础上进行改进和优化，以应用于对多种疟原虫的检测，同时将改进的可视化LAMP试剂和市售LAMP反应试剂盒进行成本-效果比较以评价其现场推广可能性，并通过对现场样本的检测以评估其现场应用价值。研究包括三个部分：一、可视化环介导等温扩增（LAMP）检测疟原虫技术的改进方法：针对疟原虫18SrRNA基因和线粒体基因属特异性保守区域在线设计引物，和文献报道的引物进行比较和筛选。对反应体系的反应温度、dNTPs浓度、MgSO4浓度、内引物浓度等进行优化。对全血和滤纸血样本分别采用DNA提取试剂盒和简化的加热处理方法提取样本DNA，评价改进的可视化LAMP技术对不同方法处理的样本的扩增效果。以恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫的全血DNA作为模板来评价改进的可视化LAMP检测疟原虫技术的特异性。以质粒梯度浓度和全血样本模拟梯度疟原虫密度样本作为模板，评估改进的可视化LAMP技术的敏感性。结果：针对疟原虫18SrRNA基因和线粒体基因属特异性保守区域在线设计出8对引物，经过比较和筛选，选用文献报道的Pg-18SrRNA引物为最适引物。经优化后改进的可视化LAMP的反应体系和反应条件为：20mMTris-HClpH8.8,10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,0.1%Tween20、8UBstDNA聚合酶、1.4mMdNTPs、9mMMgSO4、0.2μMF3和B3、2.5μMFIP和BIP、0.8μMLPF和LPB、1.0μL模板DNA，加DDW至20μL64℃反应60min。改进的可视化LAMP检测疟原虫的方法可特异地检出四种疟原虫；对不同方法处理的样本进行检测均有较好的扩增效果；最低可检测出3.1×100copy/μL的疟原虫18srRNA基因质粒DNA，扩增反应的Tt值随质粒浓度的递增按照相关关系递减；对模拟的梯度疟原虫密度全血样本最低可检测出4.863p/μL的全血样本。二、可视化LAMP和市售LAMP试剂盒的成本-效果比较方法：分别用自配试剂的可视化LAMP和市售的LAMP试剂盒对疟原虫样本进行检测，对两种LAMP检测方法的反应效率、敏感性和特异性进行检测效果的比较，并对两种检测方法的试剂成本进行比较，评价新的可视化LAMP技术用于检测疟原虫的方法在现场推广使用的可能性。结果：新的可视化LAMP技术和采购的LAMP反应试剂盒用于对疟原虫检测的特异性均较高，但新的可视化LAMP扩增效率更为优异和稳定；优化的可视化LAMP的检测敏感性（4.863p/μL）比LAMP试剂盒检测敏感性48.63p/μL高十倍；自配试剂的可视化LAMP技术检测疟原虫的检测单份样本试剂成本约为7元/份，LAMP反应试剂盒的成本约为166元/份，前者约为后者的1/24。三、可视化环介导等温扩增技术检测疟疾现场样本的应用评价方法：采用新的可视化LAMP技术对现场的滤纸血样本进行检测，并将结果与镜检结果进行比较和分析，对结果不一致的样本分别进行镜检复核、巢式PCR基因复核、样本DNA浓度检测和病例追踪调查复核，评价新的可视化LAMP检测疟原虫技术在我国消除疟疾阶段的现场应用价值。结果：采用新的可视化LAMP技术检测临床采集的网络报告疟疾病例滤纸血样本200份，检测到疟原虫阳性样本186份，阴性样本14份，与镜检结果的符合率为96.5%。与镜检结果不一致的所有样本经巢式PCR复核，结果与LAMP检测结果一致。3份经LAMP检测和巢式PCR复核阳性，但镜检为阴性的样本经省级镜检专家镜检复核后1份为间日疟阳性，但原虫密度很低（16p/μL）；另2份经镜检复核仍为阴性的样本经现场流行病学个案病例追踪调查，确认均为输入性恶性疟病例，并在采血涂片之前均服用过抗疟药物；4份LAMP检测和巢式PCR复核为阴性但镜检为阳性的样本经省级镜检专家镜检复核均为阳性，但经样本DNA浓度检测发现没有提取出DNA。结论1、本研究选用疟原虫属特异性的18SrRNA引物，建立了一种可用于检测四种疟原虫的可视化LAMP检测技术，检测敏感性达到4.863p/μL。2、新的可视化LAMP检测技术与市售LAMP反应试剂盒相比，两种方法对疟原虫的检测特异性均较高，但新的可视化LAMP扩增效率和敏感性均显著高于市售LAMP，费用仅为市售LAMP反应试剂盒的1/24。3、新的可视化LAMP检测技术对现场采集的滤纸血样本的检测结果表明具有比镜检更高的检测敏感性，可用于常规镜检很难检测的低原虫密度和已服用过抗疟药物患者血样的检测。4、新的可视化LAMP检测技术具有敏感、高效、简便、快捷和可批量检测的优点，可作为疟原虫基因检测的一个新工具，在我国消除疟疾阶段中推广应用。
【作者】徐岁；
【导师】高琪；
【作者基本信息】江苏省血吸虫病防治研究所，病原生物学，2012，硕士
【关键词】恶性疟原虫；间日疟原虫；三日疟原虫；卵形疟原虫；可视化环介导等温扩增；疟原虫显微镜检；巢式PCR；原虫密度；

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