凝溶胶蛋白在急性放射性肺损伤中的作用及其机制研究

【摘要】目的给予单次大剂量X射线照射小鼠胸部，探究凝溶胶蛋白（Gelsolin，GSN）在血浆和肺组织中的表达变化，了解GSN与急性放射性肺损伤之间的关系；构建高、低表达GSN的小鼠模型，检测血浆中自由基、炎症因子，探讨GSN是否对急性放射性肺损伤具有保护作用及其机制。方法1.20GyX线单次胸部照射Balb/c小鼠，建立小鼠急性放射性肺损伤模型。采用免疫组化法观察GSN在肺组织中的表达；在照射后6、12、24、48、72、96、120h不同时间点取小鼠血浆、肺泡灌注液（BALF）及肺组织样本，用ELISA法、WesternBlot法及RT-PCR法检测GSN在血浆、BALF及肺组织的表达变化。2.给予Balb/c小鼠尾静脉注射20μg抗凝溶胶蛋白抗体（anti-GSNantibodies），构建循环中GSN低表达的小鼠模型。随后30min内20GyX线单次照射小鼠胸部，分为：单纯照射组（none）、照射+IgG组（IgG）和照射+anti-GSN抗体组（anti-GSN）。在未照射和照射后12、24、48、72h及30d不同时间点取小鼠血浆、BALF及肺组织样本，分别测定BALF中白细胞数及总蛋白浓度，并将离心BALF后得到的沉淀进行涂片和瑞氏-吉姆萨染色；光镜观察并比较肺组织病理学改变；用WST-1法和TBA法分别测定血浆、BALF中的SOD活力和MDA含量。3.给予Balb/c小鼠气管内滴注60μl慢病毒，构建肺组织GSN高表达的小鼠模型。首先成功构建介导GSN基因表达的重组慢病毒（Lenti-GSN），随后给予小鼠气管内滴注，10天后采用16GyX线单次照射小鼠胸部，分为：照射+生理盐水组（saline）、照射+Lenti-GFP组（Lenti-GFP）及照射+Lenti-GSN组（Lenti-GSN）。每天称小鼠体重，在未照射（0d）和照射后1、15、30及60d不同时间点取小鼠血浆、BALF及肺组织样本。用ELISA和WesternBlot法验证血浆和肺组织中GSN的表达水平。测定BALF中白细胞数及总蛋白含量和肺组织中MPO活力；光镜下观察肺组织病理切片；用WST-1法和TBA法分别测定血浆中SOD活力和MDA含量；用ELISA法测定血浆中TNF-α和IL-6的含量。结果1.免疫组化显示GSN广泛分布于肺组织上皮细胞。20GyX线胸部单次照射小鼠，血浆中GSN水平在照后6-72h持续下降，随后逐渐上升，在照后120h恢复到正常水平。BALF中GSN水平则随着照后时间的延长逐渐升高，在照后96h及120h高于正常水平（P<0.05）。肺组织中GSNmRNA和蛋白表达在照后24h低于正常水平，但在照后48-96h高于正常值。2.anti-GSN组各时间点BALF中白细胞数、总蛋白浓度均明显高于none组和IgG组（P<0.05或P<0.01）；肺组织HE染色显示，与IgG对照组比较，anti-GSN组肺血管充血、出血、水肿及炎症细胞浸润明显，肺间隔增厚，肺泡腔萎缩，放射肺损伤加重。照后3dnone组和IgG组血浆及BALF中SOD活力显著高于anti-GSN组（P<0.05），MDA含量明显低于anti-GSN组（P<0.05）。3.成功构建介导GSN基因表达的重组慢病毒（Lenti-GSN）。气管滴注后10天，WesternBlot示Lenti-GSN组肺组织表达Flag标签蛋白，Lenti-GFP组和saline组未表达；Lenti-GSN组小鼠肺组织GSN含量高于Lenti-GFP组（P<0.05），血浆中GSN含量为170.648±18.291mg/l，与Lenti-GFP组（184.721±15.427mg/l）无统计学差异（P>0.05）；但照后1dLenti-GSN组小鼠肺组织GSN含量低于Lenti-GFP组（P<0.05），血浆中GSN含量为144.305±6.047mg/l，显著高于Lenti-GFP组（48.161±6.895mg/l）（P<0.01）。照后21d至照后60d，Lenti-GSN组小鼠体重明显高于对照组（P<0.05）。Lenti-GSN组在照后15d及30d肺组织MPO活力、BALF中白细胞数及总蛋白浓度均明显低于Lenti-GFP组（P<0.05或P<0.01）。肺组织病理切片显示，与Lenti-GSN组比较，Lenti-GFP组肺组织充血、水肿、肺间隔增厚明显，放射肺损伤加重。照后15dLenti-GSN组血浆中SOD活力高于Lenti-GFP组（P<0.05），MDA含量低于Lenti-GFP组（P<0.05）。照后60dLenti-GSN组血浆中TNF-α、IL-6含量明显低于Lenti-GFP组（P<0.01）。结论1.20GyX线单次照射小鼠胸部，成功建立小鼠急性放射性肺损伤模型。证明了血浆、BALF及肺组织中GSN表达变化与照后时间有相关性。2.循环中GSN低表达加剧肺组织炎症反应，增加肺血管通透性，加剧辐射诱导的小鼠急性肺损伤；其损伤加重与机体清除自由基能力降低有关。3.肺组织GSN高表达减轻肺组织炎症反应，降低肺血管通透性，减轻辐射诱导的小鼠急性肺损伤；其损伤减轻与机体清除自由基、炎症因子能力增强有关。
【作者】王洁；
【导师】刘芬菊；
【作者基本信息】苏州大学，放射医学，2014，硕士
【关键词】GSN；急性放射；肺损伤；

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