竹红菌乙素及新型拓扑异构酶抑制剂-GS-2诱导的活性氧在肿瘤细胞凋亡中的作用研究

【摘要】活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）是体内的有氧代谢产物，物理和化学因素(离子辐射、抗癌药物等)可诱发细胞凋亡，同时伴随活性氧的产生（如H2O2、·OH、O-2、NO等)。光敏药物和拓扑异构酶抑制剂是有效的抗肿瘤药物，在其诱导肿瘤细胞凋亡过程往往伴随ROS的产生。本文研究了光敏剂竹红菌乙素（HypocrellinB,HB）诱导的细胞凋亡及其活性氧自由基（包括NO）的重要作用，同时针对新型拓扑异构酶抑制剂GS-2的细胞毒性，研究了ROS在其毒性产生过程中的作用。本文为探讨天然光敏药物及人工合成的拓扑异构酶抑制剂的抗肿瘤分子机制提供了理论参考，为揭示活性氧小分子信号在凋亡诱导中的作用提供了研究方法，为开发两类抗肿瘤药物提供了实验依据。本论文已成功完成以下四部分内容：一、HB光毒性的初步研究HB在光照15min,30min,1h,2h,3h时的IC5（0半数抑制率）值分别是5.35,4.35,4.12,3.4,3.1μM。且HB对HepG2细胞的生长抑制具有浓度依赖性以及光照时间依赖性。我们采用流式细胞仪检测HB在光照条件下诱导的凋亡情况，AnnexinV-FITC/PI双染结果显示处理组细胞凋亡率是对照组的4.00倍，而Sub-G1峰表征的凋亡由对照组的15.69%上升到了31.52%。另外，HB光照后能使HepG2细胞产生G2/M期阻滞，说明HB在光照条件下能诱导肿瘤细胞凋亡。二、H2O2和NO在HepG2细胞凋亡诱导中的作用我们分别采用DCFH-DA和DAF-FMDA探针通过流式细胞仪测定细胞内H2O2和NO的产生，发现5mMHB在600lux光照强度下，诱导HepG2细胞产生H2O2，且在光照10min时达到迸发最大值；同时也可诱导NO的产生，其产生量随光照时间的延长而增加。然而当我们采用DHE检测超氧阴离子的产生时，发现HB光照不能诱导O-2的产生，说明HB光照过程中主要产生的ROS是H2O2和NO。当采用ROS的抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）预处理1h，能显著提高细胞的存活率，降低其凋亡率。随后，通过westernblot法检测到光照过程中细胞内一氧化氮合酶（iNOS和eNOS）的表达不断上升，说明了NO在细胞内的来源，因此采用一氧化氮合酶抑制剂L-NMMA预处理1h，显著降低了细胞的存活率，其凋亡率上升。这是首次发现NO在HB诱导细胞凋亡中的保护作用，为深入探究NO在其中的作用，又采用外源NO的清除剂cPTIO或NO供体SNP预处理HepG2细胞1h，发现cPTIO使细胞存活率降低，凋亡率上升；而SNP使细胞存活率上升，凋亡率下降。同样，实验结果显示NO可以影响HB激活的caspase3和9的活性。说明NO可能通过线粒体途径参与细胞凋亡的调节。三、新型拓扑异构酶抑制剂GS-2诱导乳腺癌细胞凋亡GS-2对乳腺癌细胞MDA-MB-231的生长抑制具有浓度和时间依赖性。AO/EB双染结果可定性看出GS-2诱导细胞凋亡，单细胞电泳（彗星电泳）法结果显示GS-2作用24h，随着浓度的增加，出现拖尾的细胞个数逐渐增多，最多高于50%的细胞DNA收到损伤，即发生凋亡。而作为凋亡信号因子，caspase3和9在18h被GS-2激活，活性均上升至对照组的2.3倍，说明细胞可能通过线粒体途径凋亡。四、ROS在GS-2诱导细胞凋亡中的作用我们采用DCFH-DA探针流式细胞仪检测到不同浓度GS-2处理MDA-MB-231细胞后，细胞内ROS的量显著增加，线粒体膜电位下降，同时细胞内抗氧化酶活性上升，跟对照组比，SOD的酶活性分别上升了14.5，23.0和39.0倍，CAT的活性分别上升了1.52，5.01和21.31倍。采用抗氧化剂NAC预处理细胞1h后，细胞存活率分别上升至105.39%，110.91%，105.25%，完全恢复其线粒体膜电位，且细胞凋亡率下降，在GS-2浓度为5mM时，细胞的凋亡率由49.57%下降至6.00%。在研究凋亡通路的过程中，发现NAC降低了caspase3的活性，由对照组的2.3倍降低至1.8倍。同时我们通过RT-PCR和qPCR检测GS-2对TopI和TopIIα在mRNA水平表达的影响，结果显示GS-2对TopI和TopIIα具有显著的抑制作用。NAC预处理后，TopI和TopIIα的表达均有所上升。说明新型拓扑异构酶抑制剂GS-2通过ROS途径诱导细胞凋亡。本文首次发现NO在天然光敏药物HB诱导产生的细胞凋亡过程中起保护作用；并首次证明ROS介导新型人工合成拓扑异构酶抑制剂GS-2诱导的细胞凋亡，同时首次在转录水平上验证GS-2对TopoI和TopoIIα的强烈抑制作用。本文不仅为探讨天然光敏药物及人工合成的拓扑异构酶抑制剂的抗肿瘤分子机制提供了理论参考，为揭示活性氧小分子信号在凋亡诱导中的作用提供了研究方法，还为开发两类抗肿瘤药物提供了实验依据和参考。
【作者】嵇源源；
【导师】王剑文；
【作者基本信息】苏州大学，微生物与生化药学，2014，硕士
【关键词】活性氧；竹红菌乙素；拓扑异构酶抑制剂；肿瘤细胞；

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