RIP3功能启动子的鉴定及其调控研究

【摘要】研究背景和目的：受体相互作用蛋白激酶3（Receptor-InteractingProteinKinase-3,RIPK3orRIP3）参与肿瘤坏死因子(Tumornecrosisfactor,TNF)或Toll样受体(Toll-likereceptors,TLRs)介导的细胞坏死信号通路，有文章报道RIP3在细胞凋亡中也起到调控作用。研究表明，RIP3介导的细胞坏死在胰腺炎等疾病中发挥重要作用。因此，对于RIP3表达调控机理研究具有十分重要的意义，但是至今为止关于RIP3的调控机理研究尚未报道。因此，本课题旨在研究RIP3转录调控机制，鉴定核心启动子区域并对其调控机制做进一步研究。研究方法：（1）通过检测细胞活力检测不同结肠癌细胞系对TNF-α诱导的细胞坏死敏感性；（2）利用蛋白免疫印迹检测不同结肠癌细胞系中RIP3的表达水平；（3）利用荧光素酶双报告基因系统对RIP3启动子区域进行活性分析；（4）利用过表达系统在293T细胞中验证转录因子Sp1蛋白对RIP3启动子活性的影响；（5）利用RNAi技术在293T细胞中验证转录因子Sp1蛋白对RIP3启动子活性的影响；（6）利用EMSA实验验证Sp1与RIP3启动子区域的相互作用；（7）通过检测细胞活力检测稳定表达Sp1-shRNA的HT-29细胞系对TNF-α诱导的细胞坏死的敏感性；（8）利用BSP方法检测RIP3启动子区域的甲基化水平。研究结果：（1）不同结肠癌细胞系对TNF-α诱导的细胞坏死的敏感性不同。诱导不同结肠癌细胞系发生TNF-α诱导的细胞坏死，通过检测细胞活力发现不同细胞系对TNF-α诱导的细胞坏死的敏感性不同。（2）不同结肠癌细胞中RIP3的表达水平有差异。通过蛋白免疫印迹实验发现对TNF-α诱导的细胞坏死敏感性与结肠癌细胞中RIP3的表达水平呈正相关。（3）RIP3启动子关键区域集中在5’非翻译区(5’-non-translatedregion,5’UTR)区域以及5’UTR上游19个碱基片段。通过构建含有RIP3启动子区域不同长度片段的重组质粒，在293T细胞中进行荧光素双报告基因系统的检测发现RIP3启动子活性关键区域包含RIP3基因的5’UTR以及5’UTR上游19个碱基片段。（4）转录因子Sp1结合位点对RIP3启动子活性起到关键调控作用。通过对包含RIP3基因的5’UTR以及5’UTR上游19个碱基片段序列分析，发现该段序列含有三个Sp1结合位点，通过对这三个Sp1结合位点进行突变，发现第二个Sp1结合位点对RIP3启动子活性调控起到关键作用。（5）Sp1调控RIP3启动子活性。在293T细胞中过表达Sp1可以促进RIP3启动子活性，转染针对Sp1的siRNA降低Sp1的表达后，RIP3基因的转录活性降低。（6）Sp1结合到RIP3启动子区域。EMSA以及CHIP实验显示Sp1与RIP3的启动子区域相互结合，而且这种结合可以被Sp1抗体竞争性抑制；（7）低表达Sp1的HT-29细胞对TNF-α诱导的细胞坏死敏感性降低。实验发现表达Sp1-shRNA的HT-29细胞系对TNF-α诱导的细胞坏死敏感性降低。（8）在不表达RIP3的结肠癌细胞HCT-116中，反式作用因子Sp1结合位点发生甲基化，抑制RIP3的转录。对RIP3启动子区域进行亚硫酸氢盐修饰后，然后进行测序发现在不表达RIP3的结肠癌细胞HCT-116中，RIP3启动子区域高度甲基化。结论：我们首次报道了RIP3的转录调控机理，发现Sp1在结肠癌细胞中调控RIP3基因的转录进而影响其对TNF-α诱导的细胞坏死的敏感性。在一些不表达RIP3的结肠癌细胞系中，RIP3启动子区域发生甲基化，从而抑制了RIP3基因的表达。本实验结果提示在临床治疗相关疾病中，可以通过靶向RIP3启动子区域的Sp1结合位点或甲基化位点，研发特异性药物调控RIP3的表达，进而缓解疾病症状并达到治疗效果。
【作者】李军；
【导师】何苏丹；
【作者基本信息】苏州大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】受体相互作用蛋白激酶3；转录活性；启动子；甲基化；

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