内质网应激通路在纳米ZnO诱导小鼠肝毒性中的作用及机制

内质网应激通路在纳米ZnO诱导小鼠肝毒性中的作用及机制

作者:师大云端图书馆 时间:2018-01-04 分类:参考文献 喜欢:1808
师大云端图书馆

【摘要】研究背景:纳米ZnO优良的光催化作用、抗菌性能、紫外线吸收能力及选择性杀伤癌细胞的作用,使其成为倍受青睐的一种纳米材料,广泛用于电子行业、食品工业、化妆品及生物医药等领域。纳米ZnO的广泛应用已引起了人类对其生物安全性的关注。近年来有关纳米ZnO安全性评价的研究发现:在细胞水平,纳米ZnO可引起细胞代谢、应激反应、细胞信号转导和凋亡等改变;在动物实验中,纳米ZnO通过灌胃、气管灌注、吸入、注射等途径进入体内后,再通过血液循环到达全身各个器官,如心、肝、脾、肺、肾等,并损伤其功能。已有研究证实,口服进入体内的纳米ZnO可通过胃肠静脉系统吸收入肝脏并通过诱导氧化应激引起肝细胞凋亡。但是,具体的分子机制并不清楚。目前,氧化应激是国内外公认的纳米材料的主要损伤机制。而氧化应激是如何触发细胞凋亡信号通路并在纳米材料诱导的肝损伤中起作用的?凋亡是程序性的细胞死亡,目前已知的3条凋亡途径包括死亡受体途径、线粒体途径和内质网应激途径。内质网是真核细胞蛋白质合成、翻译后修饰、折叠和组装的场所,也是细胞内Ca2+储存的场所,与物质运输、物质交换、解毒作用密切相关。肝细胞内含有大量的内质网,氧化应激、缺血再灌注损伤及各种毒物都可影响内质网的结构和功能,诱导内质网应激反应,继而引起细胞凋亡、肝损伤等一系列级联反应。因此我们提出这样的假设:在纳米ZnO诱导小鼠肝毒性中,ROS损伤了内质网的结构和功能,进而激活了内质网应激信号通路,引起肝细胞损伤。目的:确认口服纳米ZnO后对小鼠肝脏的亚急性及慢性损伤作用,阐明内质网应激信号通路在纳米ZnO诱导的中毒性肝损伤中的作用及机制,揭示纳米ZnO引起的中毒性肝损伤的发病机制,为中毒性肝损伤的防治提供新思路,并为纳米ZnO的生物安全性研究提供新数据。方法:1.亚急性肝毒性模型:实验用50只C57雄性小鼠(6周龄,体重20-22g)每组10只,随机分成纳米ZnO组(100、200、400、600mg/Kg)和生理盐水对照组,连续灌胃14天,以建立纳米ZnO的亚急性肝损伤模型。检测血清中肝功能指标ALT、AST、ALP水平;HE染色后光镜下观察肝脏组织病理改变;检测肝组织匀浆氧化应激相关指标SOD、MDA;ELISA法测定肝组织匀浆凋亡蛋白Caspase3、Caspase9、Caspase12的含量;RT-PCR法检测凋亡相关基因bcl-1、bcl-2、bax及GRP94的mRNA表达水平。2.慢性肝毒性模型:实验用50只C57雄性小鼠(6周龄,体重20-22g)每组10只,随机分成纳米ZnO组(200mg/Kg、400mg/Kg)、普通ZnO组(200mg/Kg、400mg/Kg)和生理盐水对照组,连续灌胃90天,以建立纳米ZnO的慢性肝损伤模型。检测血清中肝功能指标ALT、AST、ALP水平;HE染色后光镜下观察肝脏组织病理改变;检测肝组织匀浆氧化应激相关指标SOD、MDA、GSH;ELISA法测定肝组织匀浆凋亡蛋白Caspase3、Caspase9、Caspase12的含量;RT-PCR法检测凋亡相关基因bcl-1、bcl-2、bax及内质网应激相关基因CHOP、GRP94、GRP78、PDI、XBP-1的mRNA表达水平;Westernblot法检测内质网应激通路蛋白PERK、p-PERK、Eif2a、p-Eif2a、JNK、p-JNK及凋亡蛋白CHOP的蛋白表达水平;透射电镜观察肝脏内质网形态及结构的变化;免疫组化法检测肝组织中CHOP的表达水平。结果:在不同浓度纳米ZnO诱导的亚急性肝毒性模型中,血清肝功能指标ALT在纳米ZnO组(200mg/Kg.600mg/Kg)中明显升高,ALP在纳米ZnO组(400mg/Kg、600mg/Kg)中明显升高,其改变与对照组比较有统计学意义(P<0.05);肝组织病理结果变化不明显,仅在(100mg/Kg、200mg/Kg)纳米ZnO组中见炎症细胞浸润和少量点状坏死;纳米ZnO组中肝组织匀浆氧化应激指标SOD、MDA水平均明显升高(P<0.05)肝组织匀浆中凋亡蛋白Caspase12含量在纳米ZnO组(200、400、600mg/Kg)中均明显升高(P<0.01),Caspase9含量在纳米ZnO组(600mg/Kg)中明显升高(P<0.05);抗凋亡基因bcl-1、bcl-2在纳米ZnO组表达水平明显降低,而促凋亡基因bax及内质网分子伴侣基因GRP94表达水平上调,其差异具有统计学意义(P<0.01)。在纳米ZnO诱导的慢性肝损伤模型中,血清肝功能指标ALT、AST在纳米ZnO组(200mg/Kg、400mg/Kg)中均明显升高,其改变与对照组比较有统计学意义(P<0.05);肝组织病理结果显示,在纳米ZnO组可见灶状坏死及中央静脉扩张淤血;纳米ZnO组中氧化应激水平明显升高,表现为:与对照组比较,其GSH水平明显降低;而MDA、SOD水平明显升高,其差异有统计学意义(P<0.01)纳米ZnO组中Caspase3、Caspase9、Caspase12的含量与对照组比较均明显升高,其差异有统计学意义(P<0.05);纳米ZnO组抗凋亡基因bcl-1、bcl-2基因表达水平明显低于对照组,且促凋亡基因bax、CHOP基因表达水平明显高于对照组,其差异具有统计学意义;纳米ZnO组内质网应激相关基因GRP94、GRP78、PDI.XBP-1表达水平明显高于对照组,其差异具有统计学意义(P<0.01);Westernblot检测结果发现纳米ZnO组p-Eif2α、p-JNK、p-PERK、CHOP蛋白表达水平均高于对照组;电镜观察内质网结构及形态发现纳米ZnO组的内质网肿胀,核糖体脱颗粒明显,对照组内质网结构正常;免疫组化结果表明,纳米ZnO组的CHOP表达水平明显高于对照组及普通ZnO组。结论:本实验条件下,反复灌胃不同浓度(100、200、400、600mg/Kg)的纳米ZnO造成的小鼠亚急性肝毒性,主要是通过氧化应激机制介导,其损伤程度与纳米ZnO的灌胃浓度无明显剂量效应关系。纳米ZnO灌胃小鼠的慢性肝毒性模型证实,纳米ZnO灌胃小鼠后诱导氧化应激的发生,ROS产生过多破坏了内质网的结构和功能,进而激活了内质网应激凋亡信号通路,诱导肝细胞凋亡
【作者】杨霞;
【导师】江米足;
【作者基本信息】浙江大学,儿科学,2014,硕士
【关键词】纳米ZnO;内质网应激;凋亡;氧化应激;肝毒性;

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