人源过氧化氢酶的重组稳定表达、PEG修饰和抗病毒性肺炎作用研究

【摘要】过氧化氢酶(Hydrogenperoxide:hydrogen-peroxideoxidoreductase,EC1.11.1.6)是机体抗氧化体系的一种关键酶,可高效分解生理和病理条件下生命体产生的过氧化氢,减轻活性氧簇(Reactiveoxidativespecies,ROS)对组织造成的氧化损伤。本研究结果表明,过氧化氢酶以及机体ROS的含量与病毒性疾病的发展过程密切相关。病毒入侵导致机体过氧化氢酶活力的耗竭以及ROS含量的升高,而外源性过氧化氢酶的补充能在一定程度上缓解病毒性疾病的进程。本实验室从人胚胎肝细胞提取总RNA,通过分子生物学手段获取了完整的人源过氧化氢酶基因,并在此基础上构建了一株重组酵母菌株S4。然而在进行表达时发现,该菌株的稳定性较差,传代后重组的人源过氧化氢酶基因出现了丢失和沉默,对人源过氧化氢酶的大量获取造成了限制。因此,本研究选用pPICZaA作为穿梭载体,选用GS115作为表达宿主菌,对重组人源过氧化氢酶酵母菌株进行了重新构建,并对其遗传稳定性进行了研究。结果表明,所获得的重组菌株G13遗传稳定性更强,表达量也得到了大幅度的提升,由原有菌株的600U/mL提高到1500U/mL。在此基础上,对重组菌株G13进行了10L发酵罐发酵,并利用Q-Sepharose阴离子交换树脂对发酵上清进行分离纯化,获得了纯化倍数超过了十倍,达到电泳纯的酶,且酶活回收率达77%,产物经过western-blot验证确定为人源过氧化氢酶。所获得的重组人源过氧化氢酶比活力达到26.57kU/mg,与商品化的酶活力相当。该研究结果为人源过氧化氢酶的稳定和高效表达以及产物积累提供了一条可行的途径。人源过氧化氢酶由于在血液循环中迅速被代谢失活,血浆半衰期极短。此外,人源过氧化氢酶对存储环境变化比较敏感,容易变性或降解而失去活性。这些性质使人源过氧化氢酶在在药理学研究和临床开发应用上受到了极大的限制。本研究选用PEG-5000作为修饰剂对重组表达所获得的人源过氧化氢酶进行了结构修饰,并优化了修饰条件。最终通过凝胶过滤对主要修饰产物实现了分离。通过对修饰前后的重组人源过氧化氢酶的酶学性质进行研究和比较,证明所得到的PEG修饰产物与未修饰的酶相比,比活力上升了20%,且在热稳定性、pH稳定性上都有所提高。PEG修饰虽然使人源过氧化氢酶的亲和力有所下降,但其最大反应速度由修饰前的72.47mmol/(min-L)上升到153.84mmol/(min-L)。此外,PEG修饰使人源过氧化氢酶在ICR小鼠体内的血浆半衰期由少于15min延长至约75min。PEG修饰在一定程度上改善了人源过氧化氢酶的稳定性,为人源过氧化氢酶的研究和应用提示了一条可能的途径。通过鼻腔给药方式,本研究对不同剂量的PEG修饰的重组人源过氧化氢酶对流感病毒H1N1鼠肺适应株(FM1)引起的急性肺炎的治疗作用进行了研究并推测其作用机制。结果表明,流感病毒入侵使肺部的抗氧化防御能力明显下降,而且抑制了吞噬细胞的功能,从而在肺组织中大量复制。病毒同时激活机体的免疫反应,使细胞因子水平显著升高,在肺部形成炎症细胞浸润和肺水肿,在肺表面出现大面积的病灶区域,使实验小鼠体重急速下降,最终导致小鼠死亡。PEG修饰的人源过氧化氢酶在不同程度缓解了上述病理症状,且作用效果随着剂量的上升而增强。PEG修饰的人源过氧化氢酶通过鼻腔直接作用于肺部,使肺部病变区域的抗氧化状态得到较好的改善。100,000U/kgPEG修饰的人源过氧化氢酶将病毒入侵后肺部的过氧化氢酶活力由72U/mgprot提高至209U/mgprot,对超氧阴离子的清除能力由67U/mgprot提高至161U/mgprot,而脂质过氧化反应产物MDA的含量则由病毒组的1.6nmol/mgprot降低至1Onmol/mgprot。PEG修饰的人源过氧化氢酶主要通过直接减轻病毒引起的肺部氧化损伤而起到缓解急性肺炎的作用。与此同时,PEG修饰的人源过氧化氢酶对病毒性肺炎小鼠免疫系统状态也产生了影响,这种作用存在两面性。一方面,PEG修饰的过氧化氢酶可降低甚至解除流感病毒所导致的对小鼠脾脏和胸腺功能的抑制,增强吞噬细胞对病毒的吞噬和清除,增强非特异性免疫；而另一方面,PEG修饰的人源过氧化氢酶表现出对Th1型类细胞因子的抑制倾向,而对Th2型细胞因子无明显影响,借此调节组织中的Th1/Th2,使免疫应答向体液免疫方向偏移,从而降低过度免疫引起的组织损伤。对病毒入侵后肺组织信号传导通路的分析结果显示,PEG修饰的人源过氧化氢酶表现出下调肺组织的TLR-2和NF-κB基因表达的趋势。其中100,000U/kgPEG修饰的人源过氧化氢酶对TLR-2和NF-κB表达的下调效果具有显著性。根据以上结果,推测人源过氧化氢酶可能通过如下机途径对流感病毒急性肺炎进行作用：第一,外源给予人源过氧化氢酶直接消除了病毒感染所引起的病理状态下过量的过氧化氢并同时使其他抗氧化酶能力上升,直接减轻ROS造成的氧化应激损伤。第二,肺组织ROS含量的降低减弱了NF-κB的活化程度,使其表达下降,继而下调与免疫相关的细胞因子的表达并使免疫从细胞免疫向体液免疫便宜,从而降低炎症反应造成的损伤。第三,PEG修饰的人源过氧化氢酶有效提高了吞噬细胞的吞噬功能,增强机体对病毒的清除能力,降低病毒含量。通过以上三条途径,’PEG修饰的人源过氧化氢酶有效对抗流感病毒株FM1导致的急性肺炎,减少肺部病毒滴度,减缓急性肺炎的病理进程,从而减少肺组织损伤,最终降低小鼠的死亡率。实验结果提示,PEG修饰的人源过氧化氢酶具备被进一步研究开发为治疗感染引发的氧化应激损伤的药物的潜力。
【作者】施志慧；
【导师】周珮；史训龙；
【作者基本信息】复旦大学，药物化学，2011，博士
【关键词】人源过氧化氢酶；毕赤酵母；PEG修饰；氧化损伤；免疫调节；

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