过表达DBR2基因对黄花蒿青蒿素及其相关代谢物生物合成的影响

【摘要】青蒿素(Artemisinin)是从黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)中提取出的一种新型倍半萜内酯化合物,由于其独特的过氧桥结构,对脑型疟疾和抗氯喹疟疾疗效显著并且具有低毒和速效的特点。世界卫生组织(WorldHealthOrganization,WHO)将以青蒿素为基础的联合疗法(ArtemisininCombinationTherapies,ATCs)作为治疗疟疾的首选方法,这使得青蒿素市场需求非常巨大。然而,目前青蒿素仅在黄花蒿植株中发现,且含量很低,只占干重的0.01%-1%。除此以外,由于青蒿素的全化学合成路线复杂、成本高、产率低、毒性大等诸多因素,使其很难实现工业化生产。所以,青蒿素的供应远远不能满足患者的需求。因此,致力于提高黄花蒿植株中青蒿素的含量已经是植物次生代谢研究领域的热点之一。青蒿醛△11(13)双键还原酶(ArtemisinicaldehydeΔ11(13)reductase,DBR2)是烯醇还原酶家族成员之一,其功能是以青蒿醛为底物,催化生成二氢青蒿醛(二氢青蒿酸的前体),使得代谢流向青蒿素合成方向流动。近年来,随着青蒿素生物合成途径研究的深入,利用代谢工程技术手段通过靶点基因进行遗传操作从而获得转基因高产株系已经被证实是提高青蒿素含量行之有效的方法之一。目前青蒿素生物合成途径上的几个关键酶基因均有转基因研究报道,然而青蒿醛△11(13)双键还原酶基因对青蒿素生物合成的作用依然缺乏转基因证据,所以本实验将通过代谢工程技术手段,在黄花蒿中过表达DBR2基因,以期获得青蒿素含量提高的转基因黄花蒿,并从转基因水平提供DBR2基因功能的直接证据。本研究根据NCBI所报道的相关DBR2基因序列(登录号：EU704257),采用RACE技术,从黄花蒿中克隆了DBR2基因,并对所克隆出的序列进行了分析,结果与NCBI已报道的DBR2基因cDNA序列的一致性达到了96%。构建含有目的基因DBR2的高效植物表达载体pCAMBIA1305-DBR2,并将其转入根瘤农杆菌LBA4404菌株中,从而获得目标工程菌LBA4404-pCAMB1A1305-DBR2.以黄花蒿无菌苗叶片为材料,采用叶盘法进行黄花蒿的遗传转化,将DBR2基因导入黄花蒿中；并以8mg·L-1潮霉素(Hygr)作为抗性筛选压力,进行抗性筛选从而获得抗性芽,待抗性芽长至2-3cm时将其分离转至MS+NAA(0.05mg·L-1)+Cef(200mg.L-1)培养基上诱导生根并进行多次继代培养。待农杆菌除菌完全后,设计跨35S启动子检测引物,对抗性黄花蒿植株进行基因组PCR检测。在所有的抗性植株中，有7个黄花(?)株系能同时检测到抗性基因(Hvgr)和目的基因(DBR2)并且在这7个黄花蒿株系中检测不到毒区基因(virDl)表达,说明转基因苗不存在农杆菌污染造成的假阳性,故而将这7个黄花蒿株系确立为转基因黄花蒿株系并编号为D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7.为检测转基因植株中DBR2基因表达情况,以RPⅡ作为内参基因,荧光定量PCR分析,结果显示在所有DBR2过表达株系中,DBR2基因的表达量与对照比较均有显著性提高。用高效液相色谱仪(HPLC)分析青蒿素等相关代谢产物的含量,结果显示：非转基因黄花蒿植株中青蒿素含量很低(0.94±0.35mg?g-1,DW),然而在转基因的7个株系中青蒿素的含量与非转基因的黄花蒿相比都得到显著性的提高,其青蒿素干重含量分别是1.92±0.69mg?g-1、1.50±0.20mg?g-1、1.73±0.08mg?g-1、1.91±0.21mg?g-1、1.72±0.30mg?g-1、1.95±0.24mg?g-1、2.14±0.20mg?g-1,其中D7株系青蒿素含量最高达到了2.144±0.20mg.g-1,是非转基因黄花蒿的2.26倍。二氢青蒿酸作为青蒿素的直接前体物质,也应得到提高,经HPLC检测证实了这一点：与非转基因黄花蒿(0.87±0.03mg?g-1,DW)比较,在转基因的7个株系中,二氢青蒿酸的含量都得到提高,其干重含量分别是1.23±0.20mg?g-1、1.46±0.36mg?g-1.39±0.39mg?g-1、1.09±0.27mg?g-1、1.51±0.38mg?g-1、1.50±0.16mg?g-1、1.93±0.19mg?g-1、在这7个转基因株系中,二氢青蒿酸含量最高可达1.93±±0.19mg·g-1,是非转基因黄花蒿的2.22倍。然而,意外地发现,过表达DBR2基因使得处于青蒿素生物合成竞争途径上的代谢产物(青蒿素B及其前体物质青蒿酸)含量也都得到提高,尤其是青蒿酸的含量与非转基因黄花蒿(0.02±0.003mg?g-1,DW)相比,都得到极显著地提高：含量最高达到0.19±-0.02mg.g-1是对照的9.06倍,最低(0.11±±0.03mg·g-1)也是对照的5.48倍。综上所述：在黄花蒿中过表达DBR2基因对青蒿素及其相关代谢物的积累具有重要作用,通过该转基因方法获得的青蒿素及其相关代谢物含量较高的黄花蒿新品系,可为青蒿素的商业化生产提供优选的植物材料。
【作者】袁媛；
【导师】廖志华；
【作者基本信息】西南大学，遗传学，2014，硕士
【关键词】黄花蒿；DBR2；过量表达；青蒿素；相关代谢物；

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