MiR-17-92簇在小鼠心肌缺血—再灌注中的作用
【摘要】第一部分野生型小鼠心肌miR-17-92簇表达及在缺血损伤后的改变目的：已知miR-17-92簇在哺乳动物中极为重要,并且在心肌中较高表达,但其在缺血-再灌注中的作用仍未知。本研究考察野生型小鼠心肌中miR-17-92簇各成员的表达水平以及其在缺血损伤中的变化。方法：取C57BL/6的野生型小鼠的心脏提取全RNA,使用实时定量PCR(real-timePCR)测定miR-17-92簇各成员的表达水平。随后对野生型小鼠行冠状动脉前降支结扎手术,术后1天,4天,7天取心脏测定心肌miR-17-92簇各成员表达水平的变化。结果：正常野生型C57BL/6小鼠心肌细胞中miR-17-92簇各成员按照表达水平排序依次为miR-92a,miR-19a/19b家族,miR-17/20a家族,miR-18a。它们占整个基因簇成员表达量的比例依次为62%,21%,16%,1%。在接受前降支结扎手术后1天,4天,7天,除miR-18a表达水平与术前无显著差异,其它成员表达量均降低至术前的约30%-50%,p值均<0.05。miR-18a表达极低,在术后仍只占总表达量的2%-3%。结论：MiR-17-92簇在野生型C57/BL6小鼠心肌中,各成员表达不一致。MiR-92a,miR-19a/19b,miR-17/20a高表达,miR-18a低表达。小鼠心肌缺血-再灌注后1-7天miR-17-92簇各成员除miR-18a表达基本不变,其它成员表达均明显下调,提示miR-17-92簇在心肌缺血损伤中具有作用。miR-17-92簇下调在小鼠心肌缺血-再灌注损伤中的作用目的：通过培养条件基因敲除转基因小鼠研究miR-17-92簇在心肌缺血-再灌注损伤中的作用。方法：将miR-17-92簇floxed(miR-17-92F/F)转基因小鼠与αMHC-MerCreMer(aMHC-MCM)转基因小鼠交配,产生双转基因小鼠(αMHC-MCM/miR-17-92F/F)。6-8周的小鼠分为对照组和研究组。对照组喂食玉米油,研究组即基因敲除组喂食tamoxifen诱导Mer-Cre-Mer敲除心肌miR-17-92簇。两组小鼠均接受缺血-再灌注手术,再灌注24小时时处死并进行TTC-PhthalocyanineBlue染色。或者两组小鼠取术前或术后24小时的心脏进行westernblot检测。结果：基因敲除组miR-17-92簇各成员表达量较对照组明显下降,约为对照组的30%-50%,p均<0.05。缺血-再灌注24小时后,基因敲除组(n=10)梗死区／危险区比例显著高于对照组(n=7)(63.6±3.9%vs41.0±3.1%,p<0.05)。westernblot发现raf-l-Mek1/2-MAPKl通路成员和Akt的磷酸化在基因敲除组均显著下降,血红素氧化酶1在对照组显著升高,而在基因敲除组无明显升高。而在生长因子撤除的凋亡通路中,基因敲除组的抗凋亡因子bcl-2降低,而促凋亡因子bax和bak显著上升,最后造成凋亡指标剪切型PARP,caspase3显著增加。结论：miR-17-92簇下降增加了心肌缺血-再灌注的损伤；途径是miR-17-92簇下降抑制了Raf-1/Mek1/2/Erk1/2通路和PI3K/Akt通路的磷酸化；抑制了血红色氧化酶1的生成；使得抗凋亡因子减少,促凋亡因子增加,从而增加了细胞凋亡。miR-17-92簇在小鼠心脏前体细胞缺氧-再灌注损伤中的作用目的：以miR-17-92F/F转基因小鼠心脏前体细胞(cardiacprogenitorcells,CPCs)为材料,体外缺氧-再灌注为模型,在体外实验中证实第二部分体内实验的结果。方法：从miR-17-92F/F转基因小鼠心脏通过C-kit磁珠筛选,选出miR-17-92F/FCPCs.CPC分为两组,一组转染腺病毒ad-GFP作为对照组,另一组转染腺病毒ad-cre作为基因敲除组。半月后,测定基因敲除组基因敲除效果。体外双氧水损伤实验后使用测定caspase3/7,并对缺氧-再灌注的细胞进行westernblot测定各种蛋白变化。结果：miR-17-92F/FCPC敲除miR-17-92簇后检测miR-17-92簇各成员的表达量,各成员或者家族表达量为miR-17/20a0.0944±0.004,miR-18a0.240±0.097,miR-19a/b0.234±0.019,miR-92a0.023±0.007,p均<0.05。对照组和基因敲除组在0.6mmH202或1.1mmH202处理后测定caspase3/7,分别为(1.035±0.0187VS1.253±0.077,p<0.05)和(1.242±0.016VS1.521±0.037,p<0.05)。证明基因敲除组细胞凋亡增加。Westernblot再次证实raf-1-Mekl/2-MAPK1通路成员和Akt的磷酸化在基因敲除组均显著下降；缺氧诱导因子la(hypoxia-induciblefactor1a)在基因敲除组升高,但血红素氧化酶1在对照组显著升高,而在基因敲除组无明显升高。在生长因子撤除的凋亡通路中,基因敲除组的抗凋亡因子bcl-2降低,抗凋亡因子Mcl-1升高,而促凋亡因子bim,bad和bak显著上升,最后造成凋亡指标剪切型caspase9,,caspase3显著增加。结论：miR-17-92簇下降增加了CPC缺氧-再灌注的损伤；miR-17-92簇下降抑制了Raf-1/Mekl/2/Erk1/2通路和PI3K/Akt通路的磷酸化；增加了HIFla,但却抑制了血红色氧化酶1的生成；miR-17-92簇下降使得抗凋亡因子bcl-2减少,Mcl-1增加,促凋亡因子增加,综合起来从而增加了细胞凋亡。创新点1.本研究首次报道miR-17-92簇与心肌缺血-再灌注损伤有关,并通过培养的转基因动物在体内水平证实miR-17-92簇敲除会加重缺血-再灌注损伤；2.本研究首次报道miR-17-92簇敲除引起MAPK1通路磷酸化下降；3.已知HIFla3’UTR有miR-17的靶点,所以HIFla增加,但首次发现其下游的Hemeoxygenasel反而下降。提示microRNA的作用并不始终与靶点一致,特定条件下有可能相反。不足与改进措施缺少miR-17-92簇过表达的模型。改进措施：培养条件过表达miR-17-92簇的小鼠。
【作者】周密；
【导师】赵强；
【作者基本信息】复旦大学，外科学，2011，博士
【关键词】microRNA；miR-17-92；心脏；心肌缺血；心肌缺血-再灌注；心脏前体细胞；缺氧-再灌注；microRNAs；
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