新型抗抑郁药物调节小鼠皮层神经元钾通道的新机制

【摘要】抑郁症(depression)是一种常见的心境障碍,可由各种原因引起,临床表现为中枢神经系统兴奋性低下,同时伴有显著而持久的心境低落,且心境低落与其处境不相称,严重者可出现自杀念头和行为。抗抑郁药(antidepressant)是众多精神药物的一个大类,主要用于治疗抑郁症和各种抑郁状态。新型抗抑郁药物是从80年代后开始陆续研发出的第二代抗抑郁药物,此类抗抑郁药物疗效比第一代抗抑郁药物显著,同时具有抗胆碱能作用弱、对心血管系统影响小等特点,因此被称为是一类安全性较高的抗抑郁药物。目前对于新型抗抑郁药物的报道主要集中在研究它们对心血管调节的药理功能,也有文献报道抗抑郁药物对动物行为的调节作用和对中枢神经系统代谢调节等现象。而关于新型抗抑郁药物对中枢神经元细胞膜离子通道调节的报道非常少,目前为止还没有文献对新型抗抑郁药物调节神经元钾通道的细胞分子机制进行相关报道,更没有文献提供抑郁症治疗和神经元细胞膜钾通道之间联系的直接证据。本文以小鼠皮层神经元钾离子通道为主要研究对象,使用全细胞膜片钳记录、大脑切片电生理记录、免疫组化、免疫印记蛋白定量测试以及分子克隆技术等方法,研究探索新型抗抑郁药物阿莫沙平(amoxapine,AXP)和潜在抗抑郁药噻庚啶(cyproheptadine,CPH)调节小鼠皮层神经元外向延迟整流型钾电流(IK)的分子细胞机制,为临床上以钾通道为药物靶点来开发疗效更好、副作用更少的抗抑郁药提供实验思路和理论依据。本文的研究结果表明,新型抗抑郁药物在调节小鼠皮层神经元钾通道时,存在由G蛋白受体耦联的第二信使调节下游信号通路的间接调控新机制。研究主要分为以下三个部分：第一部分：我们以离体培养的小鼠皮层神经元为细胞模型,研究了新型抗抑郁药阿莫沙平对小鼠皮层神经元外向延迟整流型钾电流(IK)的调节机制。通过全细胞膜片钳记录,我们发现AXP可显著抑制离体培养的皮层神经元上TEA敏感的IK；在浓度为10μM～500μM范围内,这种抑制作用具有浓度依赖性。同时,在100μM浓度的AXP的作用下,IK的半激活电位和半失活电位均向超级化方向偏移。此外,应用PKA信号通路激动剂forskolin和db-cAMP均可以模拟AXP对皮层神经元IK的抑制作用,并且PKA信号通路阻断剂H-89可以显著消除AXP的抑制作用。免疫细胞化学和ELISA测定结果表明,AXP孵育后的皮层神经元胞内cAMP的浓度显著升高。这些结果说明AXP可能通过cAMP/PKA信号通路来调节皮层神经元IK。进一步的研究发现一定浓度的5-羟色胺(5-HT)Ⅱ型受体抑制剂和G蛋白Gs亚基的阻断剂均可以抑制AXP介导的皮层神经元IK下降,提示我们AXP可能通过5-HT受体来增强胞内cAMP/PKA信号通路,进而调节皮层神经元电压门控钾离子通道的磷酸化位点。最后利用Kv2.1-α亚单位的特异性阻断剂.JZTX-Ⅲ和在HEK293细胞中转染小鼠Kv2.1-α亚单位的电生理结果表明,AXP抑制皮层神经元IK作用的靶位点是皮层神经元Kv2.1-α亚单位。这些结果提示我们新型抗抑郁药物阿莫沙平可以通过胞内信号途径间接地调节钾通道,而不是此前很多文献报道的对钾通道直接的抑制,为我们下一步深入了解其他类型抗抑郁药对钾通道调节带来新的思考空间,同时也可以为临床上筛选抗抑郁药提供参考。第二部分：这部分结果是在完成AXP通过胞内信号途径调节皮层神经元钾通道的基础上进行的,目的在于进一步探讨其他抗抑郁药调节皮层神经元钾通道的潜在分子机制,同时寻找以电压门控钾离子通道为药物靶点,治疗抑郁症的新方法。我们的体外配体和受体结合实验研究结果首次证明,另一个潜在的抗抑郁药噻庚啶可以作为sigma-1受体的配体,通过激活sigma-1受体耦联的μ型阿片肽受体抑制皮层神经元胞内的PKA信号通路,进而去磷酸化皮层神经元电压门控钾离子通道,增加外向钾电流。通过离体培养的皮层神经元全细胞膜片钳记录,我们发现胞内给予不同浓度的CPH可显著增强离体培养的皮层神经元上TEA敏感的IK；在浓度为20nM～20μM范围内,这种增强作用具有浓度依赖性。Westernblot测定神经元胞内pPKA含量结果表明,CPH孵育后的神经元胞内pPKA含量较未孵育的对照组有显著下降。与AXP调节IK机制类似,我们同时也证明cAMP/PKA信号通路在调节钾通道方面的作用机制可以通过去磷酸化Kv2.1-α亚单位来增强皮层神经元IK。这提示我们CPH将会显著改变神经元静息膜电位,同时影响皮层神经元细胞膜的兴奋性,为进一步研究药物提高神经元兴奋性进而增强中枢神经系统的兴奋奠定了细胞分子方面的基础。第三部分：有了前面两部分结果之后,我们将目光转向脑组织切片和整体动物的研究上来。研究目的在于验证CPH是否可以改变神经元的兴奋性。对小鼠前额叶皮层的脑切片全细胞膜片钳记录发现,CPH显著改变锥体神经元诱发动作电位的频率,同时也使得神经元静息膜电位显著朝去极化方向改变。产生这一现象的主要原因是CPH通过sigma-1受体改变了PKA下游的磷酸酶活性,去磷酸化内向整流钾通道造成的。活体动物行为学实验表明,CPH可以显著增强小鼠在自发活动行为中的运动路程,这个效果与咖啡因造成的小鼠多动现象类似,提示我们CPH将可以作为一个潜在兴奋中枢神经的药物,在临床上治疗神经系统兴奋性低下的轻度抑郁症。
【作者】何彦林；
【导师】梅岩艾；
【作者基本信息】复旦大学，生物物理学，2012，博士
【关键词】阿莫沙平；噻庚啶；皮层神经元；延迟整流型钾电流；sigma-1受体；cAMP/PKA；

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