Vps18在小鼠神经细胞存活、迁移和树突发育中的功能以及应用piggyBac转座子筛选肿瘤抑制基因

【摘要】临18基因是C类Vps基因家族的一员,在进入溶酶体的膜泡运输中发挥着重要作用。但是Vps18在哺乳动物中的生理功能目前尚无报道。应用基因打靶技术,我们在小鼠中剔除了Vps18基因。我们发现Vps18全身性基因剔除导致胚胎死亡或早期新生儿死亡。而神经细胞特异性剔除小鼠,Vps18FI/FI;Nestin-Cre(Vps18CKO),呈现出明显的生长迟缓,并且在出生后12天内全部死亡。我们的研究发现Vps18CKO小鼠患严重的神经退行性疾病。对其发病机制的研究揭示在Vps18缺陷的神经细胞中,进入溶酶体的多条膜泡运输途径被阻断,包括自噬途径、内吞途径和溶酶体蛋白酶合成途径。自噬泡、晚期内吞泡和多层体在神经细胞中大量积累,正是这些膜泡运输途径的紊乱导致了神经细胞的凋亡。我们的研究还发现Vps18缺陷阻碍神经细胞迁移和浦肯野细胞树突发育。进一步的研究显示,Vps18CKO小鼠脑神经细胞表面β1Integrin表达上调,而通过RNAi的方法降低β1Integrin的表达可以部分回复Vps18CKO小鼠神经细胞的迁移缺陷。研究还显示Vps18缺失介导的小脑辐射状胶质细胞纤维结构异常可能是导致Vps18CKO鼠神经细胞迁移缺陷的另一个原因。而Vps18缺失介导的Lox蛋白的累积则可能阻碍浦肯野细胞树突发育。我们的研究揭示了Vps18基因在调控神经细胞存活、迁移和树突发育中的重要生理功能,为研究人类神经退行性疾病的诊断和防治新策略提供了新的理论依据和思路。癌症是导致人类死亡的重要杀手之一。虽然在过去的几十年里人们对癌症发生发展的分子机理进行了大量的研究,但是癌症还远远没有被攻克。在全基因组范围内系统性的筛选肿瘤抑制基因,对于揭示癌症的分子机理以及帮助我们开发和改进抗癌药物至关重要。逆转录病毒和转座子是哺乳动物中常用的插入突变剂。人们常在这些插入突变剂中放入强启动子,在小鼠体细胞中随机过表达基因组中的内源基因来筛选原癌基因。由于要在体细胞中利用插入突变同时破坏抑癌基因的两个拷贝十分困难,到目前为止,这些插入突变剂还没有能够被用来筛选抑癌基因。piggyBac(PB)转座子被证明是哺乳动物中效率最高的转座子。我们制作了一个不具有强启动子活性,但携带剪切受体和polyA转录终止信号的PB转座子。这个PB转座子能在基因组中阻断基因表达但不能激活周围基因表达。我们用这个PB转座子建立了带有高拷贝转座子并且能高效转座的PB转基因小鼠。然后,我们将这个PB转基因小鼠与MMTV-neu乳腺癌小鼠相结合用以在小鼠中筛选抑癌基因。我们初步的结果显示不带强启动子的PB转座子的插入突变虽然对MMTV-neu诱发的乳腺的发生和转移没有促进作用,但是却能够在小鼠中诱发心脏肿瘤。通过对肿瘤中PB插入位点的分析,我们定位了可能的抑癌基因Ctnna3,从而首次证明不具有强启动子活性的PB插入突变可用以在小鼠体细胞中筛选抑癌基因。我们的研究为日后利用插入突变在小鼠中大规模筛选抑癌基因奠定了基础。
【作者】彭超；
【导师】陶无凡；
【作者基本信息】复旦大学，发育生物学，2012，博士
【关键词】Vps18；C类Vps蛋白复合体；神经细胞凋亡；神经细胞迁移；神经树突发育；自噬途径；内吞途径；溶酶体；piggyBac转座子；抑癌基因；心脏肿瘤；乳腺癌；

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