若干补肾与益气中药对大鼠哮喘模型的作用与机制研究

【摘要】目的应用若干补肾益气中药淫羊藿、补骨脂、黄芪及太子参干预SD大鼠哮喘模型,明确补肾和益气中药对哮喘气道炎症的干预作用和作用环节,包括对致炎和抑炎因素的双向调节作用,特别是对免疫和下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamic-pituitary-adrenocortical,HPA)轴系统相关的环节；进一步探讨补肾和益气中药对哮喘气道高反应性及气道重塑的作用及其机制。方法1.将150只SD大鼠按随机数字法分为15组,每组10只,即正常对照组(Normal)、哮喘模型组(OVA)、地塞米松干预组(Dex)、淫羊藿苷低、中、高剂量干预组(Epi2.5、5.0、10.0)、补骨脂低、中、高剂量干预组(PF2.5、5.0、10.0)、黄芪低、中、高剂量干预组(AM2.5、5.0、10.0)、太子参低、中、高剂量干预组(PS2.5、5.0、10.0)。2.用卵蛋白致敏和雾化激发的方式建立哮喘模型。3.采用Buxco气道阻力和肺顺应性有创检测系统测定气道高反应。4.采用HE染色观察肺组织炎症变化,PAS染色观察肺组织气道粘液分泌变化,Masson三色染色观察气道壁周围胶原沉积变化。病理图像分析气道炎症程度、气道粘液分泌程度,以及气道壁周围胶原沉积面积。5.采用酶联免疫吸附法检测肺泡灌洗液和血清中INF-y、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-a和TGF-β1的水平变化。6.采用流式流式细胞术检测肺泡灌洗液Treg细胞比例。7.采用酶联免疫吸附法检测血清中ACTH和CORT的变化。8.采用realtimePCR法测定下丘脑CRHmRNA的变化。9.采用免疫印迹法测定下丘脑组织Bax、Bcl-2、Fas、FasL、CleavedCaspase-3蛋白表达。10.采用TUNEL法测定下丘脑、垂体、肾上腺组织细胞凋亡变化。结果1.肺功能测试显示模型组大鼠气道阻力(RL)较正常组显著升高,而肺顺应(Cdyn)性显著下降(P<0.05)。与模型组比较,地塞米松可显著改善肺功能(P<0.05)。一定剂量的淫羊藿、补骨脂、黄芪可不同程度降低气道阻力,改善肺顺应性(P<0.05)。而太子参各剂量组大鼠气道阻力、肺顺应性与模型组比较均无显著差异(P>0.05)。2.肺组织HE染色气道炎症评分结果显示,哮喘模型组气道炎症指数显著提高,与正常大鼠相比具有显著差异(P<0.05)。地塞米松可显著抑制气道炎症,淫羊藿中、高剂量组,补骨脂高剂量组,黄芪中、高剂量组均可显著抑制大鼠气道炎症(P<0.05)。而淫羊藿低剂量组,补骨脂低、中剂量组,黄芪低剂量组,太子参低、中、高剂量组均不能有效抑制气道炎症(P>0.05)。3.肺组织PAS染色结果显示,哮喘模型组黏液分泌显著增加,与正常组比较有显著区别(P<0.05)。地塞米松组气道粘液分泌显著降低,淫羊藿中、高剂量组,补骨脂高剂量组,以及黄芪中、高剂量治疗组气道粘液分泌量较模型组显著下降(P<0.05)。而淫羊藿低剂量组,补骨脂低、中剂量组,黄芪低剂量组,太子参低、中、高剂量组均不能有效缓解气道粘液分泌(P>0.05)。4.肺组织Masson三色染色结果显示,哮喘模型组气道壁周围胶原面积显著增加,与正常组比较有显著差异(P<0.05)。地塞米松组气道壁周围胶原面积较模型组显著下降(P<0.05)。淫羊藿低、中、高剂量组,以及黄芪低、中、高剂量组气道周围胶原沉积面积较模型组显著降低(P<0.05),而补骨脂低、中、高剂量组,太子参低、中、高剂量组与模型组比较无显著差异(P>0.05)。5.与正常大鼠相比,哮喘模型组大鼠肺泡灌洗液细胞因子INF-γ水平显著下降,而IL-4、IL-5、IL-13、TGF-β1和TNF-α水平显著升高(P<0.05)。地塞米松可显著降低IL-4、IL-5、IL-13、TGF-β水平(P<0.05)。一定剂量的淫羊藿能显著降低肺泡灌洗液中IL-4、IL-5和IL-13水平(P<0.05),一定剂量的补骨脂能显著降低肺泡灌洗液中IL-4与IL-13水平,一定剂量的黄芪能显著升高肺泡灌洗液INF-γ水平,降低IL-4、IL-5、IL-13和TGF-β水平(P<0.05)；太子参各剂量组肺泡灌洗液上述细胞因子均无显著变化(P>0.05)。6.与正常大鼠相比,哮喘模型组较正常组血清INF-γ水平显著下降,IL-10水平显著升高(P<0.05),而IL-4、IL-5、IL-6、IL-13、TNF-α和TGF-β水平无明显差异(P>0.05)。一定剂量淫羊藿显著升高哮喘大鼠模型血清INF-γ水平降低TGF-β和TNF-α水平(P<0.05)；一定剂量的补骨脂可显著降低血清TGF-β水平(P<0.05)；一定剂量的黄芪高剂量显著升高哮喘模型组血清INF-γ水平,降低血清TGF-β1水平(P<0.05)；一定剂量太子参组可显著降低哮喘模型组血清TGF-p,水平(P<0.05)。7.与正常组大鼠比较,哮喘模型组CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞有下降趋势,但无显著区别(P>0.05)。与模型组相比,地塞米松组,黄芪中及高剂量组CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞比例显著升高(P<0.05)。而淫羊藿、补骨脂及太子参低、中、高剂量组CD4+CD25+Foxp3+调节T细胞比例与模型组比较无显著差异(P>0.05)。8.与正常组大鼠比较,哮喘模型组大鼠血清ACTH及CORT均无显著差异(P>0.05)。与模型组比较,地塞米松组、淫羊藿、补骨脂、黄芪及太子参低、中、高剂量组CORT和ACTH均无显著差异(P>0.05)。9.与正常组大鼠比较,哮喘模型组大鼠下丘脑CRHmRNA水平显著下降(P<0.05)。与模型组比较,地塞米松组下丘脑CRHmRNA水平与模型组比较有下降趋势,但无显著差异(P>0.05)。淫羊藿高剂量组CRHmRNA水平有升高趋势,但无显著差异(P>0.05)；而淫羊藿低、中剂量及补骨脂、黄芪、太子参低、中、高剂量下丘脑CRHmRNA含量与模型组比较均无显著差异(P>0.05)。10.哮喘模型组下丘脑组织促凋亡信号通路分子Bax、CleavedCaspase-3蛋白表达显著增加(P<0.05),而Bcl-2/Bax比值降低(P<0.05)。一定剂量的淫羊藿、补骨脂、黄芪及太子参可降低Fas蛋白表达(P<0.05),但均不能抑制Bax、Fas-L及CleavedCaspase-3蛋白表达(P>0.05),也不能提高Bcl-2蛋白表达及Bcl-2/Bax表达比值(P>0.05)。11.与正常组比较,哮喘模型组下丘脑、垂体及肾上腺组织切片细胞凋亡指数无显著差异(P>0.05)。与模型组比较,地塞米松组肾上腺皮质和下丘脑细胞凋亡指数显著增加(P<0.05),而淫羊藿、补骨脂、黄芪及太子参组与模型组比较,细胞凋亡指数均无显著差异(P>0.05)。结论1.补肾中药淫羊藿对哮喘有显著的干预作用,可改善哮喘气道炎症、气道高反应及气道重塑。淫羊藿改善气道炎症的作用与抑制Th2型细胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平密切相关,此外,淫羊藿尚有提高CRHmRNA水平,改善HPA轴作用的趋势,这可能也是其抗炎机制。补肾中药补骨脂对气道炎症和气道高反应也有一定的改善作用,其作用可能与降低Th2炎性因子IL-4和IL-13相关。淫羊藿与补骨脂相比较,同为补肾中药,淫羊藿对哮喘的干预作用显著优于补骨脂。2.益气中药黄芪对哮喘有显著的干预作用,可改善哮喘气道炎症、气道高反应及气道重塑。黄芪改善气道炎症的作用可能与抑制Th2型细胞因子水平,以及增加调节性T细胞比例相关。益气中药太子参对哮喘气道炎症、气道高反应及气道重塑无显著干预作用。黄芪与太子参相比较,同为益气中药,黄芪对哮喘的干预作用显著优于太子参。3.补肾中药淫羊藿和益气中药黄芪相比较,两者均可显著改善哮喘气道高反应性,抑制气道炎症,但淫羊藿尚有提高CRHmRNA水平,改善HPA轴作用的趋势,而黄芪尚能增加调节性T细胞数量。故淫羊藿可能具有调节免疫和HPA轴的双重作用,而黄芪的免疫调节作用更为突出。
【作者】金华良；
【导师】董竞成；
【作者基本信息】复旦大学，中西医结合临床（专业学位），2013，博士
【关键词】支气管哮喘；气道炎症；淫羊藿；补骨脂；黄芪；太子参；

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