超量表达SbMATE、CjMDH和CjDTC基因对棉花中有机酸含量的影响

超量表达SbMATE、CjMDH和CjDTC基因对棉花中有机酸含量的影响

作者:师大云端图书馆 时间:2015-10-14 分类:参考文献 喜欢:3596
师大云端图书馆

【摘要】棉花是天然植物纤维和重要的经济作物,改良棉花品种,提高棉花纤维品质具有重要意义。植物组织中有机酸作为碳代谢的中间产物,积累较多,并在众多的方面发挥着重要作用。在细胞器内和生物膜上存在大量的,不同种类的羧酸合成、转运的酶或蛋白,促进了有机酸的合成和转运。棉花胚珠和纤维的发育和有机酸密切相关,前人研究表明,苹果酸钾是使棉纤维细胞产生膨压的重要渗透溶质,柠檬酸和纤维素的合成有关。那么,通过转基因技术,调控有机酸的合成和运输,将更多羧酸转运到棉纤维细胞来增加细胞膨压和有机营养含量,进而增加纤维原始细胞的突起并促进其伸长,有可能提高棉花产量和品质。与此同时,调控有机酸合成与运输过程,消耗过多的底物(主要是碳水化合物)来增加整个植株或局部有机酸含量,有可能打破植株体内原来有机酸的平衡,和底物消耗过多对植株生长发育产生负面的影响。课题组通过对开花当天的棉花胚珠离体培养实验,分析后得到以下结果:适量浓度的羧酸能够促进胚珠的发育,而过量的羧酸可抑制胚珠的发育。为了进一步研究羧酸对棉花胚珠发育和棉花纤维伸长的影响,通过基因工程技术,用组成型启动子CaMV35S、纤维特异性启动子PGhSCFP、胚珠特异启动子PGhAILP分别控制高粱柠檬酸转运蛋白基因SbMATE、香橙苹果酸脱氢酶基因CjMDH和二/三羧酸转运蛋白基因CjDTC等三个基因的表达,构建9个超量表达的植物表达载体,并进行棉花的遗传转化。对CaMV35S组成型启动子与特异性启动子GhSCFP、GhAILP分别启动柠檬酸转运蛋白基因SbMATE、苹果酸脱氢酶基因CjMDH、二/三羧酸转运蛋白基因CjDTC的转化棉花植株进行了分子和组织化学检测,并对各转基因棉花植株进行表达水平分析,对转基因植株胚珠、叶中的主要有机酸含量进行了检测,最终筛选获得基因表达水平提高、有机酸含量增加的转基因棉花植株。其主要结果如下:1.通过组织化学染色及PCR检测对超量表达植株进行筛选,其中p5-P35S::SbMATE获得了6个转化子,转基因阳性植株共40株;p5-P35S::CjMDH获得了6个转化子,转基因棉花植株共15株;p5-P35S::CjDTC获得了8个转化子,转基因阳性棉花植株共25株;p5-PSCFP::SbMATE获得了7个转化子,转基因阳性棉花植株共53株;p5-PGhAILP::SbMATE获得了13个转化子转基因阳性棉花植株共111株;p5-PSCFP::CjMDH获得了8个转化子,转基因阳性棉花植株共32株;p5-PGhAILP::CjMDH获得了15个转化子,转基因阳性棉花植株共99株;p5-PSCFP::CjDTC获得了5个转化子,转基因阳性棉花植株共20株;p5-PGhAILP::CjDTC获得了6个转化子,转基因棉花植株共28株。2.转基因棉花植株表达水平检测结果:均筛选出基因表达量较高的转基因棉花植株。其中,以野生型植株中SbMATE的相对表达量为1,p5-P35S::SbMATE转基因棉花植株叶片中SbMATE的相对表达量为0.31-702.26;p5-PsCFP::SbMATE转基因棉花植株胚珠中SbMATE的相对表达量为0.87-99408.51;p5-PGhAILP::SbMATE转基因棉花植株胚珠中SbMATE的相对表达量为0.34-421.39。以野生型植株中CjMDH的相对表达量为1,p5-P35S::CjMDH转基因棉花植株中,叶片中CjMDH的相对表达量为6.94~153093.45;p5-PSCFP::CjMDH转基因棉花植株胚珠中CjMDH的相对表达量为62.69~343479.84;p5-PGhAILP::CjMDH转基因棉花植株胚珠中CjMDH的相对表达量为0.06-173.56。以野生型植株中CjDTC的相对表达量为1,p5-P35S::CjDTC转基因棉花植株中,叶片中CjDTC的相对表达量为439.76~53961.68;p5-PSCFP::CjDTC转基因棉花植株胚珠中CjDTC的相对表达量为582.88~7782.40;p5-PGhAILP::CjDTC转基因棉花植株胚珠中CjDTC的相对表达量为5.03-1166.62。3.对获得的转基因棉花植株进行有机酸含量分析,结果显示,与野生型WT相比,从p5-P35S::SbMATE转基因棉花植株中筛选出SbMATE表达量最高的植株,其叶片中的柠檬酸含量增加了4.65倍;从p5-P35S::CjMDH转基因棉花植株中筛选出CjMDH表达量最高的植株,其叶片中的苹果酸含量分别下降了42.75%和提高了6.99%;从p5-P35S::CjDTC转基因棉花植株中筛选出CjDTC表达量最高的植株,其叶片中的草酸含量增加了10.64%,柠檬酸含量增加了92.98%,苹果酸含量增加了4.13%;p5-PSCFP::SbMATE转基因棉花植株胚珠中柠檬酸含量下降了49.54%;p5-PSCFP::CjMDH转基因棉花植株胚珠中苹果酸含量下降了13.50%-39.42%;p5-PSCFP::CjDTC转基因棉花植株胚珠中,草酸含量提高了68.72%;柠檬酸含量提高了1.7倍;苹果酸含量提高了39.21%;p5-PGhAILP::SbMATE转基因棉花植株胚珠中柠檬酸含量提高了31.11%;p5-PGhAILP::CjMDH转基因棉花植株胚珠中苹果酸含量分别提高了8.14%-35.06%和下降了11.04%-53.76%;p5-PGhAILP::CjDTC转基因棉花植株胚珠中,草酸含量提高了31.71%,柠檬酸含量提高了11.67%,苹果酸含量下降了14.29%。4.在棉花中超量表达SbMATE可以提高胚珠中的柠檬酸含量,在纤维原始体细胞的突起和伸长时期,胚珠中柠檬酸含量下降;提高棉花种子的百粒籽棉重、籽指;在2DPA的纤维细胞中超量表达,可以提高衣指,但是在15DPA的纤维细胞中超量表达,则会降低衣指;纤维长度变短,衣分降低。5.在棉花中超量表达CjMDH降低了2DPA的胚珠中苹果酸的含量,提高了15DPA的胚珠中苹果酸的含量;提高了种子的百粒籽棉重、籽指,降低了衣指。另外,结果显示,超量表达CjMDH表达水平促进了胚珠中的苹果酸的积累;纤维长度变短,衣分降低。6.在棉花中超量表达CjDTC提高了了2DPA和15DPA的胚珠中草酸、柠檬酸的含量,降低了15DPA的胚珠中苹果酸的含量;提高种子的百粒籽棉重、籽指、百粒纤维重;衣指,衣分降低。另外,结果显示,超量表达CjDTC促进了胚珠中的柠檬酸的积累,可能对提高棉纤维的产量有重要意义。7.在棉花中超量表达SbMATE、CjMDH、CjDTC,可能导致植物在胚珠生长发育的初期就对营养物质消耗过多,对后期的纤维素的形成产生了不利的影响,导致棉纤维变短。并且超量表达SbMATE、CjMDH、CjDTC,可能对植物的形态造成不利的影响。以上结果表明:超量表达羧酸转运、合成基因对胚珠和纤维的正常发育具有重要影响。本研究对进一步揭示羧酸转运、合成基因对棉纤维/胚珠发育影响的作用机制有重要的作用。
【作者】戴蔚华;
【导师】罗小英;李德谋;
【作者基本信息】西南大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士
【关键词】羧酸;SbMATE;CjMDH;CjDTC;纤维生长发育;

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