甘蓝自交不亲和关联基因的克隆、表达分析及蛋白质相互作用研究

【摘要】自交不亲和(Self-incompatibility,SI)是植物防止近亲自交、促进异交,保持物种遗传多样性的重要机制,同时也为研究植物胞间信号传导提供了一个理想的模式系统。生产中利用不同单倍型自交不亲和系之间互配制种是芸薹属作物重要的育种方式,但具有生产过程繁杂和效率低等缺点。因此深入开展自交不亲和信号传导方面的研究,既可为阐明植物胞间信号传导机理提供全新的内容,也可为自交不亲和性的研究和利用奠定理论基础。目前普遍认为在甘蓝等芸薹属作物的花期,花粉落到柱头上以后,花粉中的SCR与柱头上的SRK胞外结构域识别并结合,引起SRK构像的变化,使其释放结合在SRK激酶结构域的THL1/THL2,激活SRK激酶活性,随后SRK与ARC1作用并使其磷酸化,进而经过一系列目前尚未知晓的途径继续传递来自胞外的信号,最终导致自花花粉萌发受阻。虽然近年来已取得了大量的有关自交不亲和信号传导的研究成果,但是仍主要围绕花粉与柱头中自交不亲和决定因子的识别及作用机理分析上,以及SRK和SCR表达调控与自交不亲和性之间的关系、SRK与THL1/THL2作用分析等。相对于上述方面,有关自交不亲和下游信号传导通路组成蛋白的分离与鉴定的研究要滞后的多,自1998年ARC1被鉴定为SRK下游信号蛋白后,直到2009年才发现自交亲和必须因子Exo70A1可与ARC1作用,但是与SCR和SRK任何一个突变或缺失都将导致材料自交不亲和性彻底丧失不同的是,反义抑制ARC1表达和过量表达Exo70A1都只能在某种程度上降低材料的自交不亲和性。由此说明ARC1与Exo70A1组成的通路可能只是SRK’下游信号传导途径的一个分支,柱头内存在其它未知蛋白与ARC1共同继续传递不亲和信号,然而其他关于下游信号蛋白的分离与鉴定研究至今还未见报道。基于国际前沿研究进展,为探索自交不亲和下游信号传导机理研究的切入点,更好的研究下游信号传导的分子机制,本论文在前期完成了自交不亲和甘蓝柱头响应自花和异花授粉差异表达蛋白质的基础上,以甘蓝纯和系A1和F1为材料,利用分子生物学技术筛选并克隆出可能参与自交不亲和下游信号传导的信号因子,进行表达分析,并利用酵母双杂交技术对下游因子间的可能的相互作用进行了初步验证。主要研究结果如下：(1)基于前期自交不亲和甘蓝柱头响应自花和异花授粉差异蛋白质研究,筛选出可能与自交不亲和反应相关的8个蛋白：BOsiPA1、BPS1、KPDP、MLP423.Tubulin、Annexin1、Annexin2和Actin,根据已报道的研究成果选出与自交不亲和相关的3个因子：ARCl、Exo70A1和MLPK,利用同源扩增克隆基因,并分别进行生物信息学分析。其中有两个比较有意义的基因,一个是bHLH转录因子BOSiPA1,序列分析表明它可能直接调控SI核心因子SCR.SRK和Exo70A1的表达进而参与自交不亲和反应；另一个是MLPK基因,共获得该基因的四个转录本MLPKf1、MLPKf2、MLPKm和MLPKi,其中MLPKf1/2是芸薹属特有的,可能是在拟南芥和芸薹属作物分化之后出现的,它们是参与SI反应的正向调控因子；与拟南芥APK1b直系同源的是我们新发现的基因MLPKi,而不是MLPKf1/2;MLPKm可能是MLPKf1和MLPKi共表达时的一个嵌合基因,这为自交不亲和信号网络的进一步研究提供新的知识。(2)以甘蓝开花当天的花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片cDNA为模板,运用RT-PCR技术,获得各基因的组织表达特异性：其中BOSiPA1、BPS1、KPDP、Tubulin、Annexin1、Annexin2和Actin在五种组织中均有表达；MLP423除了在叶片中没有表达,在其余四种组织中均有表达;MLPKf2在柱头中特异表达,MLPKfl和MLPKi在五种组织中均有表达,MLPKm除了在萼片中没有表达,在其余四种组织中均有表达。以甘蓝未授粉柱头,自交5min、30min、1h,杂交5min、30min、1h的柱头cDNA为模板,利用荧光定量PCR技术对各基因的时空表达特异性进行分析,获得各基因在不同授粉时间和方式中的表达情况：BosiPA1、BPS1、KPDP、MLP423、Annexin1、Annexin2和Exo70A1自花授粉后均上调表达,Tubulin自花授粉后下调表达,这些结果为后续实验提供了基础。(3)构建甘蓝自交不亲和关联基因Actin、Annexin、Tubulin、ARC1、Exo70A1、MLPKfl、MLPKm和MLPKi的酵母表达载体：pGADT7-Actin、pGADT7-Annexin、pGADT7-Tubulin、pGADT7-ARC1、pGBKT7-Exo70A1、pGBKT7-Annexin.pGBKT7-Tubulin、pGBKT7-MLPKf1、pGBKT7-MLPKm和pGBKT7-MLPKi,运用酵母双杂交系统检测以下组合的相互作用：pGADT7-ARC1×pGBKT7-Exo70A1、pGADT7-ARCl×pGBKT7-MLPKfl、pGADT7-ARCl×pGBKT7-MLPKmpGADT7-ARCl×pGBKT7-MLPKi、pGADT7-Actin×pGBKT7-Exo70A1、pGADT7-ActinxpGBKT7-Tubulin、pGADT7-Actin×pGBKT7-Annexin、pGADT7-Annexin×pGBKT7-Exo70A1、pGADT7-Tubulin×pGBKT7-Exo70A1和pGADT7-Tubulin×pGBKT7-Annexin,结果显示ARCl×Exo70A1、ARCl×MLPKfl.ARCl×MLPKm.ARCl×MLPKi.ActinxExo70A1.ACtin×Tubulin.ActinxAnnexin.Annexin×Exo70A1、Tubulin×Exo70A1和Tubulin×Annexin之间没有直接相互作用。(4)利用同源扩增克隆Exocyst复合体的亚基SEC3、SEC10、SEC15、SEC84N和SEC84C,构建其酵母表达载体pGADT7-SEC3、pGADT7-SEC10、pGADT7-SEC15、pGADT7-SEC84N、pGADT7-SEC84C和pGBKT7-Actin,运用酵母双杂交系统对Exocyst复合体亚基与甘蓝自交不亲和关联因子Exo70A1、Actin、Tubulin、Annexin进行相互作用研究,组合如下pGADT7-SEC3×pGBKT7-Exo70A1、pGADT7-SEC10×pGBKT7-Exo70A1pGADT7-SEC15×pGBKT7-Exo70A1、pGADT7-SEC84N×pGBKT7-Exo70A1pGADT7-SEC84C×pGBKT7-Exo70A1、pGADT7-SEC3×pGBKT7-ActinpGADT7-SEC3×pGBKT7-Annexin、pGADT7-SEC3×pGBKT7-TubulinpGADT7-SEC10×pGBKT7-Actin、pGADT7-SEC10×pGBKT7-AnnexinpGADT7-SEC10×pGBKT7-Tubulin、pGADT7-SEC15×pGBKT7-ActinpGADT7-SEC15×pGBKT7-Annexin、pGADT7-SEC15×pGBKT7-TubulinpGADT7-SEC84N×pGBKT7-Actin、pGADT7-SEC84N×pGBKT7-AnnexinpGADT7-SEC84N×pGBKT7-Tubulin、pGADT7-SEC84C×pGBKT7-ActinpGADT7-SEC84C×pGBKT7-Annexin和pGADT7-SEC84C×pGBKT7-Tubulin,结果显示Exo70A1和SEC3、Exo70A1和SEC84N之间有相互作用.
【作者】刘豫东；
【导师】高启国；
【作者基本信息】西南大学，蔬菜学，2014，硕士
【关键词】甘蓝；自交不亲和；信号传导；克隆与表达；蛋白质相互作用；

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