AcMNPV敏感宿主Spodoptera frugiperda若干免疫及表观遗传相关基因的研究

【摘要】杆状病毒科的成员是一类在自然界中仅感染节肢动物的双链DNA病毒。其中苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographacalifornicamulticapsidnucleopolyhedrovirus,AcMNPV)为杆状病毒的模式种。由于杆状病毒对宿主昆虫具有高度的致病性,对非靶标生物没有感染性,生物安全性高,不污染环境,害虫不易产生抗性等优点,世界上已有数十种杆状病毒成功用于防治农、林、牧业等相关害虫。然而杆状病毒作为生物杀虫剂也存在一些缺点,限制了它们的进步推广和应用。安全、有效地应用杆状病毒取决于对病毒的生物学、与宿主的相互作用的深入认识。自从1994年AcMNPV全基因组测序工作完成以来,已经有很多必需基因的功能被阐释,然而对其与宿主相互作用之间关系的研究大多仍停留在分子生物学水平阶段。杆状病毒在长期进化过程中与其昆虫宿主建立了严格的寄生关系,两者间相互作用、相互适应,这种作用是发生在多层次、多水平上的。我们设想从免疫学和表观遗传学这两部分入手,探寻Toll信号通路、DNA甲基化和microRNA三个方面在病毒与宿主之间相互关系中所起的作用。Toll蛋白最早发现参与果蝇背腹极性的形成,后来发现Toll信号通路也可以被微生物感染所激活,参与天然免疫应答。为了AcMNPV的宿主昆虫草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)中探寻Toll信号通路,我们分别克隆了编码Toll的同源蛋白18-wheeler、Toll的体外接头蛋白Spatzle以及Toll的胞内配体MyD88的基因。18-wheeler编码一个1274个氨基酸的蛋白质,该蛋白与家蚕和果蝇中的同源类似物的相似度分别达56%和44%。Spatzle是一个编码253个氨基酸的蛋白,与烟草天蛾中的两个同源蛋白相似度分别为50%和52%。通过蛋白序列比对分析发现在Spatzle无活性的前体中也有一个非常保守的蛋白酶切位点,可以通过该位点被切割形成有活性的成熟体。克隆得到的MyD88经过结构域的预测分析发现和该家族其他成员一样,都含有一个死亡结构域和一个TIR结构域。这些信息说明S.frugpiperda中的Toll信号通路的关键蛋白都具有一定的保守性,推测它们应该有着非常重要的功能。这些基因在AcMNPV的敏感细胞系Sf9细胞中都得到了表达。我们在斜纹夜蛾幼虫体内用各种不同的微生物或其代表分子刺激后发现,18-wheeler和Spatzle可以特异性地被金黄色葡萄球菌激活,在脂肪体和中肠内都有表达。同时,被激活的还有一种证明有抗AcMNPV病毒活性的抗菌肽Gloverin。当我们提取被金黄色葡萄球菌免疫刺激后的斜纹夜蛾幼虫血淋巴孵育Sf9也观察到了同样的效果。然而当我们试图在Sf9细胞中过表达这三个蛋白的任何一种或者两两组合来模拟天然感染状态时,却没有观测到Gloverin的提高,因此推测Sf9细胞作为非免疫组织来源细胞在长期的离体培养过程中失去了一定的免疫功能导致Toll信号通路不能被激活,所以也无法诱导Gloverin表达的升高,为AcMNPV的入侵和复制创造了有利的条件。DNA甲基化是一个非常重要的表观遗传学现象,它在高等真核生物中被认为是沉默基因表达的重要调控工具之一。这种修饰是由DNA甲基转移酶(DNMT)完成的。真核生物的DNA甲基转移酶主要有三类：DNMT1、DNMT2、DNMT3。其中DNMT2家族有着非常保守的序列特征然而对于其功能却不甚明了。前期研究表明,AcMNPV在复制过程中,病毒DNA的甲基化水平呈一定的规律性变化,而其中的机制及其与病毒复制的关系还不清楚。为了深入探讨这一问题,我们从Sf9细胞中克隆出了编码DNMT2的基因。该酶与其他家族成员一样有着非常保守的序列,它均匀分布在细胞核和细胞质中,体外酶活实验证明它有能催化DNA甲基化。我们还解析出了DNMT2与其辅酶SAH的晶体结构,和人DNMT2的结构一样,它包含一个催化区、一个底物识别结构域和一个催化环。结合的SAH与周围的氨基酸有非常强烈的相互作用,催化环和底物识别区域一起形成一个狭长的通往SAH结合位点的通道,可以用来结合和催化底物。这些结果暗示在昆虫中DNMT2也是以经典的甲基化酶催化模式来甲基化底物,这为我们在Sf9中探寻DNMT2的功能提供了线索。此外我们还在Sf9细胞中克隆出了编码DNMT1的基因,它也与其他物种中的同源蛋白有很高的相似度,与家蚕DNMT1的相似度为83%、与黑脉金斑碟的DNMT1高达74%、与蜜蜂的DNMT1相似度为50%,与人的DNMT1也有49%的相似度。结构域分析表明除了甲基化酶催化区以外,DNMT1在其N端区,包括复制叉识别结构域(RFD)、CXXC结构域和两个BAH结构域。DNMT1在病毒感染中所起的作用还在进一步的研究中。最后,我们用AcMNPV感染6小时和12小时的Sf9细胞连同未感染的细胞为对照样本,进行了细胞小RNA的深度测序。我们尝试寻找在AcMNPV这种快速裂解性的病毒中是否存在microRNA的调控,或者细胞针对病毒感染有没有产生microRNA进行主动防御。分析测序数据,发现了30个AcMNPV来源的可能编码microRNA的发夹结构的前体序列,再根据成熟体microRNA可能定位于5’或3’前体茎环臂上,一共预测出60个成熟体,对测到的读值都进行了统计分析。这些病毒来源的microRNA都是全新的,说明病毒编码的microRNA的保守性相对比较差。同样我们也测到很多宿主来源的microRNA,这些microRNA中有一部分是新的,另一部分是在已知数据库中可以找到保守序列的。针对这些microRNA做表达差异分析,发现大部分都是针对病毒感染的不同时间点有相应地提高。目前对病毒编码和宿主来源的microRNA在做进一步的靶基因预测分析和功能验证。
【作者】李思思；
【导师】钟江；
【作者基本信息】复旦大学，微生物学，2012，博士
【关键词】Spodoptera；宿主免疫；AcMNPV；microRNA；表观遗传；基因表达分析；免疫相关基因；杆状病毒；结构域；病毒基因；

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