拟南芥ABNORMAL SHOOT1(ABS1)基因的克隆与功能研究

【摘要】本文以拟南芥矮化突变体abs1-1D（abnormalshoot1-1dominant）为研究对象，针对abs1-1D与植物激素油菜素内酯（Brassinosteroid,BR）关系，对ABS1的功能、表达特异性进行了研究。同时也对ABS1的同源基因At5g47980进行了研究。主要结论如下：（1）从拟南芥激活标签突变体库中获得了一个与野生型生长发育存在显著差异的矮化突变体abs1-1D。与野生型相比，abs1-1D呈现严重的矮化表型；将同一生长时期的野生型与abs1-1D的叶片压片后发现，abs1-1D叶片褶皱、不能完全展开；abs1-1D叶片数量少、颜色深，叶柄短。遗传学分析表明，abs1-1D是一个半显性的矮化突变体。（2）Southern杂交发现，abs1-1D的矮化表型与激活标签T-DNA插入连锁。利用质粒挽救技术确定，在abs1-1D中T-DNA插入位点位于四号染色体的At4g15400和At4g15410之间，T-DNA右边界靠近At4g15400。Northern杂交发现，abs1-1D中At4g15400的表达量明显升高。（3）构建组成型花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子控制的At4g15400全长cDNA的二元植物转化载体，并转化野生型拟南芥。转基因T2代植物的表型与abs1-1D的突变表型相似。半定量RT-PCR的结果表明，这些转基因植物中At4g15400的表达量明显升高。故At4g15400的过量表达是导致abs1-1D矮化的原因，即At4g15400就是ABS1。（4）ABS1的T-DNA插入纯合突变体abs1-1（WiscDsLox474E11）的插入位点位于ABS1的编码区，距离终止密码子49bp。半定量RT-PCR结果表明，在abs1-1中检测不到全长ABS1mRNA。野生型与abs1-1在光照条件下的表型无明显差别；黑暗条件下生长7天后，abs1-1的下胚轴比野生型长，二者具有显著差异。（5）通过氨基酸序列比对发现，ABS1是BAHD酰基转移酶家族成员；其氨基酸序列中有HXXXD、DFGSG两个BAHD酰基转移酶家族的保守氨基酸序列区。ABS1的两个同源基因分别是At5g47980、At5g23970，ABS1与这两个基因编码蛋白的氨基酸序列的相似度分别为51.7%和42.1%。（6）半定量RT-PCR的结果表明，ABS1主要在根中表达，在幼苗、角果、莲座叶和花中有一定量的表达；At5g47980只在根中表达，At5g23970主要在花中表达。带有ABS1启动子控制的GUS报告基因的转基因植物GUS染色结果表明，ABS1主要在根中表达，水孔、角果中也有表达。蛋白质亚细胞定位结果显示，ABS1定位于细胞质中。（7）abs1-1D的突变表型与BR缺乏或信号转导受阻突变体的表型非常相似：abs1-1D的叶绿素含量比野生型植物的叶绿素含量高，过表达系的叶绿素含量也比野生型植物叶绿素含量高；在黑暗条件下培养七天后，abs1-1D下胚轴与野生型相比显著变短；植物第一片真叶叶柄中段的半薄切片结果表明，与野生型相比，abs1-1D和BR缺乏突变体det2-1的细胞长度明显变短。（8）通过将植物直接种植在或移栽至含有表油菜素内酯（epi-brassinolide，epi-BL）培养基的实验发现，abs1-1D和det2-1在含有epi-BL的培养基上表型恢复：叶柄伸长、叶片伸展、下胚轴伸长，表明突变体中BR缺乏。半定量RT-PCR结果表明，与野生型相比，abs1-1D、ABS1的两个独立的过表达系及det2-1中BR合成基因上调；在epi-BL处理的条件下，野生型植物中ABS1和At5g47980的表达量上调，CPD和DWF4的表达量下调；与野生型植物相比，在bes1-D中，CPD的表达量下调，ABS1的表达量上调。（9）遗传学分析结果表明，ABS1和DET2这两个基因在功能上相互协作；油菜素内酯组成型信号转导突变体bes1-D是abs1-1D的抑制突变体；过表达ABS1能够抑制光敏色素基因PHYTOCHROMEB突变体phyB-1下胚轴长的突变表型。（10）基因芯片结果表明，abs1-1D的全基因组中有383个基因表达量上调两倍及其以上、238个基因表达量下调两倍及其以上；其中，BR合成途径中的一些基因表达量上调；类黄酮合成途径的部分基因表达量下调，其中包括许多TRANSPARENTTESTA（TT）基因。（11）At5g47980的过表达系也存在矮化表型，但矮化趋势没有abs1-1D明显。与野生型相比，At5g47980的过表达系在光照条件下培养时，叶片数量少，叶片更圆；在黑暗条件培养时，过表达系存在去黄化的表型。At5g47980过表达系植物育性不良。At5g47980启动子-GUS融合基因表达结果和植物组织半定量RT-PCR结果表明，At5g47980主要在植物的根中表达。
【作者】王梦姣；
【导师】郁飞；
【作者基本信息】西北农林科技大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】拟南芥；矮化；去黄化；BAHD酰基转移酶；油菜素内酯；

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