CD49f和miR-302对奶山羊雄性生殖干细胞体外培养生物学特性的影响

【摘要】奶山羊是重要的经济动物，具有生产肉、奶等经济价值，利用奶山羊乳腺作为生物反应器生产生物药制品具有巨大的应用前景。采用雄性生殖干细胞作为种子细胞开展奶山羊的遗传育种以及转基因的研究是目前的研究热点。雄性生殖干细胞负责成年雄性个体的精子生产；在体外适宜培养条件下，其可形成类似胚胎干细胞样的多能干细胞。CD49f已经被证实是人和小鼠雄性生殖干细胞的有效标记，与细胞的多能性关系密切。miR-302能调控细胞的多能性，具有重编程人体细胞至多能干细胞的潜能。一直以来，有关家畜雄性生殖干细胞体外培养形成多能干细胞的机制的研究进展较缓慢。本试验探索了CD49f作为奶山羊雄性生殖干细胞分离、鉴定标记的有效性；优化了奶山羊雄性生殖干细胞的体外培养体系；体外培养比较CD49f阴、阳性细胞的生物学功能差异；体外转导永生化基因至奶山羊雄性生殖干细胞，探索奶山羊雄性生殖干细胞永生化的可能性及其生物学特性；转导miR-302至永生化的奶山羊雄性生殖干细胞，探索miR-302对奶山羊雄性生殖干细胞生物学特性的影响；结合前人的研究结果，尝试解析CD49f和miR-302调节奶山羊mGSCs生物学特性的机制。研究结果如下：（1）电子克隆得到奶山羊CD49fmRNA和氨基酸序列，同源性分析证实山羊CD49f与牛、大鼠、人、小鼠的相似度在80%以上。CD49f阳性细胞定位于奶山羊睾丸中曲细精管的基底膜上，与CD90、PLZF、ETV5、H3K9me3及PGP9.5等雄性生殖干细胞标记分子共定位。利用CD49f抗体进行免疫磁珠筛选得到了CD49f阳性细胞并证实其能够表达CD49f、CD90、VASA和PLZF等mGSCs标记；在MEF饲养层上培养后能形成SSC样克隆，细胞生物学特性与已报道的其他物种的mGSCs相似。（2）含有GDNF、EGF、bFGF的SSC培养基更适合体外培养奶山羊mGSCs，其在克隆形态、mGSCs相关基因的表达方面均优于去分化培养基、N2B27培养基等。多聚赖氨酸处理后的培养皿培养奶山羊mGSCs能够提高其克隆率，但不利于细胞增殖。SSC培养基中添加5μmol/LP53抑制剂结合多聚赖氨酸处理能改善奶山羊mGSCs的增殖。（3）SSC培养基体外培养CD49f阴、阳性细胞于层粘连蛋白、多聚赖氨酸上，证实CD49f阳性细胞比阴性细胞具有更好的克隆形成能力，QPCR证实CD49f阳性细胞高表达CD49f、PLZF、OCT4、PCNA、Pou3f1和SOX2等基因，低表达P21；体外经RA诱导后其能形成精子样细胞，免疫荧光染色证实其能表达减数分裂标记；进一步分析证实CD49f阳性细胞高表达miR-302b、OCT4、SOX2、PLZF和CDK2，而低表达P21。免疫荧光染色证实OCT4、Ki67在CD49f阳性细胞中定位于细胞核中，而在CD49f阴性细胞中则定位于细胞质中。（4）体外转导含SV40大T抗原和Bmi1基因的慢病毒载体至奶山羊mGSCs后建立了永生化的奶山羊mGSCs细胞系。细胞增殖能力检测证实了永生化后细胞增殖能力上调明显；RT-PCR及免疫荧光染色证实永生化奶山羊mGSCs表达CD90、CD49f、BLIMP1、C-Myc、NANOG、PLZF、OCT4、STRA8、TERT、Gfra1、CD117、VASA、SOX2、CDK2、CyclinD1、PCNA、PLZF等标记；分化能力及睾丸移植试验均证实了所建立的永生化奶山羊mGSCs系具有mGSCs的特征。转导miR-302进入永生化的奶山羊mGSCs中能促进细胞贴壁、抑制细胞凋亡，QPCR证实miR-302能够抑制P21、促进CD49f的表达。初步确定其可能通过抑制P21和促进CD49f的表达而发挥作用。（5）结合前人的研究结论，初步证实CD49f阳性细胞的增殖受到PI3K信号通路的调节；生物信息学预测结合试验验证，发现CD49f通过上调C-Myc、E-Cadherin及OCT4等分子影响奶山羊mGSCs生物学特性，miR-302通过上调细胞内E-Cadherin、OCT4及P21等促进奶山羊mGSCs的贴壁和增殖；CD49f与miR-302之间的相互调控可能通过E-Cadherin、OCT4等实现。综上所述，本研究发现CD49f可以作为奶山羊mGSCs鉴定及富集的有效标记；优化了奶山羊mGSCs体外无饲养层的培养体系；建立了永生化的奶山羊mGSCs细胞系；转导miR-302后促进奶山羊mGSCs的贴壁和增殖；结合前人的结论、生物信息学分析及试验验证，初步解析了CD49f、miR-302影响奶山羊mGSCs及二者相互作用的分子机制，为后续进一步解析奶山羊mGSCs的生物学特性及分子机制奠定了基础。
【作者】朱海鲸；
【导师】华进联；
【作者基本信息】西北农林科技大学，临床兽医学，2014，博士
【关键词】CD49f；miR-302；雄性生殖干细胞；奶山羊；

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