AM共生机制研究：AM真菌与植物根系的识别及AM功能相关基因

【摘要】本研究以丛枝菌根（arbuscularmycorrhizas，AM）真菌Gigasporamargarita、Glomusmosseae、Glomusintraradices（现为Rhizophagusirregularis）和植物日本百脉根（Lotusjaponicus）、胡萝卜（Daucuscarota）、菊苣（Cichoriumintybus）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）、高粱（Sorghumbicolor）、白三叶草（Trifoliumrepens）等为材料，通过顶空固相微萃取、气质联用分析、实时定量PCR、蛋白体外表达、凝胶迁移滞后分析、RNA干扰、激光扫描共聚焦显微等技术和方法探索了预共生阶段AM真菌与植物的相互识别机制及AM特异性诱导基因的功能。主要结果和结论如下：1.根际土中AM真菌孢子活力调查所调查的柠条（Caraganakorshinskii）、沙棘（Hippophaerhamnoides）、刺槐（Robiniapseudoacacia）、小叶杨（Populussimonii）和108速生杨（PopuluseuramericanaMoench.108）5种造林树种均被AM真菌侵染，平均侵染率分别为79.2%、76.0%、71.0%、63.8%和59.9%。通过引入活性孢子密度和可萌发孢子密度两个新指标发现，5种树种根际活性孢子密度和可萌发孢子密度均低于根际孢子密度。其中，活性孢子密度最低为35个/100g干土（柠条），最高为835个/100g干土（刺槐）；可萌发孢子密度最低为9个/100g干土（小叶杨），最高为428个/100g干土（刺槐）。AM高侵染率却伴随着根际土中低活性孢子密度和低可萌发孢子密度，即AM高侵染率与低孢子活力间存在矛盾。这种矛盾说明AM真菌与植物根系间存在着高效的相互识别机制。AM在不同植物中的普遍存在和高侵染率表明AM的形成对宿主植物有着重要的潜在功能。2.AM双重培养体系的构建基于AM真菌孢子体积小、易贴壁，表面消毒困难的特性，发明了一种操作简易、便于拆卸灭菌和可重复利用的AM真菌孢子的移取工具和一种操作简单、对孢子活性影响小的AM真菌孢子的表面消毒方法；通过无菌苗的培养获得了白三叶草离体根、利用外源激素诱导了胡萝卜愈伤组织、通过发根农杆菌（Agrobacteriumrhizogenes）转化法诱导了胡萝卜发根；建立了G.mosseae与胡萝卜发根，G.intraradices与菊苣发根的双重培养体系。结果发现，新生孢子不能萌发是限制G.mosseae应用于双重培养体系的关键因素。3.AM真菌对宿主植物的识别和响应采用液培法收集、制备白三叶草根系分泌物和水提物，比较了它们对G.mosseae孢子萌发和菌丝生长的影响。结果表明，根系分泌物对AM真菌孢子萌发和菌丝生长没有明显促进作用，植物的水提物能够显著促进孢子萌发、菌丝生长和分枝，其中茎叶水提物对孢子萌发率的促进作用最大，萌发率是对照的2.3倍；离体根系水提物对菌丝生长和分枝的促进作用最大，菌丝长度和分枝数分别是对照的2.5和5.2倍。另外，植物水提物能够促进次生孢子的形成。通过AM真菌和胡萝卜发根隔离共培养，验证了AM真菌和植物根系能够通过挥发物相互识别：接收到AM真菌释放的挥发物后，根系分枝显著增加，分枝数分别是对照的1.9倍（G.mosseae）和1.7倍（G.intraradices）；根毛数量显著减少，根毛出现频度为对照的76.8%（G.mosseae）和67.6%（G.intraradices）。AM真菌在接收到植物根系释放的挥发物后，菌丝调整生长方向朝向根系生长。4.植物根系对AM真菌的响应将Gi.margarita的孢子与植物通过Cellophane膜隔离或者接种在彼此分隔的不同培养基上共同培养，结果发现，Gi.margarita孢子萌发所产生的分泌物（GSEs）和挥发性有机物（GVCs）均能促进日本百脉根根系分枝，且根系分枝数分别从共培养的第6天（GSEs）和第7天（GVCs）开始与对照差异显著；使用LjCATOR突变体进一步发现，与GSEs不同，GVCs对根系分枝的促进作用不依赖于LjCASTOR基因。对7个AM共生相关基因转录水平的分析发现，LjCCD7可能参与GVCs对植物根系发育的调控。GVCs同样能够促进非宿主植物拟南芥的根系分枝，而GSEs则抑制根系分枝。5.AM真菌对根系释放的挥发性有机物的影响对高粱设置接种AM真菌（G.mosseae或G.intraradices）和不接种处理。通过顶空固相微萃取结合气质联用技术，从高粱根系中共鉴定出44种挥发性有机物（VOCs），其中对照18种，接种G.mosseae的21种，接种G.intraradices的17种。3个处理中，直链烷烃类化合物均是根系释放的最主要的挥发物，分别占VOCs总量的73.6%（对照）、56.8%（接种G.mosseae）和34.9%（接种G.intraradices）。与未接种AM真菌的植物比较，接种AM真菌后根系释放更多醇类和酸类物质；未接种AM真菌的根系没有检测到支链烷烃类物质；接种AM真菌的根系中没有检测到醛类物质。这些结果说明AM的形成能够改变根系释放的VOCs，并且这种改变有菌种特异性。6.AM中转录因子LjMAMI的功能分析使用原核表达体系构建LjMAMI蛋白体外表达载体，利用Denaturing方法提取纯化了LjMAMI蛋白。通过EMSA试验初步验证了LjMAMI蛋白能够结合MYCS和P1BS两个位于LjPT4基因启动子区域的顺式作用元件，为LjMAMI蛋白调控LjPT4基因的表达提供了依据。对LjMAMITILLING（TargetingInducedLocalLesionsINGenomes）突变体的表型分析发现，2084突变体幼苗茎的分枝数相对野生型植物显著增加，是野生型的1.3倍；随着幼苗的生长，茎分枝的区别逐渐消失，说明这种性状可能仅在幼苗期出现。成苗期的突变体相比野生型植物，生长滞后，植株矮小，说明LjMAMI可能参与植物的生长调控。7.AM特异性诱导的LjPT4的功能分析通过RNA干扰技术成功抑制了LjPT4的表达，突变体中LjPT4的表达量仅为对照的14.6%。利用荧光染色和激光扫描共聚焦显微技术发现，LjPT4被部分沉默后丛枝败育，突变体中消解丛枝比例为74.6%，与对照差异极显著，说明LjPT4对维持AM中丛枝的形态有重要功能。TBO染色发现，多聚磷酸盐（Polyphosphates）在LjPT4突变体的丛枝细胞中大量累积，不能转运到植物细胞，说明LjPT4对共生体中磷酸盐的转运不可或缺。当LjPT4被部分沉默后，根系的形态没有发生变化，而且当植物接种AM真菌后，突变体根系生物量与对照也没有明显区别。另外，当LjPT4基因的表达量下降时，LjMAMI的表达量同样下降。
【作者】孙学广；
【导师】唐明；
【作者基本信息】西北农林科技大学，森林保护学，2014，博士
【关键词】挥发性物质；双重培养体系；信号识别；根系分枝；磷酸转运蛋白；

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