AM共生机制研究:AM真菌与植物根系的识别及AM功能相关基因

AM共生机制研究:AM真菌与植物根系的识别及AM功能相关基因

作者:师大云端图书馆 时间:2015-11-13 分类:期刊论文 喜欢:2427
师大云端图书馆

【摘要】本研究以丛枝菌根(arbuscularmycorrhizas,AM)真菌Gigasporamargarita、Glomusmosseae、Glomusintraradices(现为Rhizophagusirregularis)和植物日本百脉根(Lotusjaponicus)、胡萝卜(Daucuscarota)、菊苣(Cichoriumintybus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、高粱(Sorghumbicolor)、白三叶草(Trifoliumrepens)等为材料,通过顶空固相微萃取、气质联用分析、实时定量PCR、蛋白体外表达、凝胶迁移滞后分析、RNA干扰、激光扫描共聚焦显微等技术和方法探索了预共生阶段AM真菌与植物的相互识别机制及AM特异性诱导基因的功能。主要结果和结论如下:1.根际土中AM真菌孢子活力调查所调查的柠条(Caraganakorshinskii)、沙棘(Hippophaerhamnoides)、刺槐(Robiniapseudoacacia)、小叶杨(Populussimonii)和108速生杨(PopuluseuramericanaMoench.108)5种造林树种均被AM真菌侵染,平均侵染率分别为79.2%、76.0%、71.0%、63.8%和59.9%。通过引入活性孢子密度和可萌发孢子密度两个新指标发现,5种树种根际活性孢子密度和可萌发孢子密度均低于根际孢子密度。其中,活性孢子密度最低为35个/100g干土(柠条),最高为835个/100g干土(刺槐);可萌发孢子密度最低为9个/100g干土(小叶杨),最高为428个/100g干土(刺槐)。AM高侵染率却伴随着根际土中低活性孢子密度和低可萌发孢子密度,即AM高侵染率与低孢子活力间存在矛盾。这种矛盾说明AM真菌与植物根系间存在着高效的相互识别机制。AM在不同植物中的普遍存在和高侵染率表明AM的形成对宿主植物有着重要的潜在功能。2.AM双重培养体系的构建基于AM真菌孢子体积小、易贴壁,表面消毒困难的特性,发明了一种操作简易、便于拆卸灭菌和可重复利用的AM真菌孢子的移取工具和一种操作简单、对孢子活性影响小的AM真菌孢子的表面消毒方法;通过无菌苗的培养获得了白三叶草离体根、利用外源激素诱导了胡萝卜愈伤组织、通过发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)转化法诱导了胡萝卜发根;建立了G.mosseae与胡萝卜发根,G.intraradices与菊苣发根的双重培养体系。结果发现,新生孢子不能萌发是限制G.mosseae应用于双重培养体系的关键因素。3.AM真菌对宿主植物的识别和响应采用液培法收集、制备白三叶草根系分泌物和水提物,比较了它们对G.mosseae孢子萌发和菌丝生长的影响。结果表明,根系分泌物对AM真菌孢子萌发和菌丝生长没有明显促进作用,植物的水提物能够显著促进孢子萌发、菌丝生长和分枝,其中茎叶水提物对孢子萌发率的促进作用最大,萌发率是对照的2.3倍;离体根系水提物对菌丝生长和分枝的促进作用最大,菌丝长度和分枝数分别是对照的2.5和5.2倍。另外,植物水提物能够促进次生孢子的形成。通过AM真菌和胡萝卜发根隔离共培养,验证了AM真菌和植物根系能够通过挥发物相互识别:接收到AM真菌释放的挥发物后,根系分枝显著增加,分枝数分别是对照的1.9倍(G.mosseae)和1.7倍(G.intraradices);根毛数量显著减少,根毛出现频度为对照的76.8%(G.mosseae)和67.6%(G.intraradices)。AM真菌在接收到植物根系释放的挥发物后,菌丝调整生长方向朝向根系生长。4.植物根系对AM真菌的响应将Gi.margarita的孢子与植物通过Cellophane膜隔离或者接种在彼此分隔的不同培养基上共同培养,结果发现,Gi.margarita孢子萌发所产生的分泌物(GSEs)和挥发性有机物(GVCs)均能促进日本百脉根根系分枝,且根系分枝数分别从共培养的第6天(GSEs)和第7天(GVCs)开始与对照差异显著;使用LjCATOR突变体进一步发现,与GSEs不同,GVCs对根系分枝的促进作用不依赖于LjCASTOR基因。对7个AM共生相关基因转录水平的分析发现,LjCCD7可能参与GVCs对植物根系发育的调控。GVCs同样能够促进非宿主植物拟南芥的根系分枝,而GSEs则抑制根系分枝。5.AM真菌对根系释放的挥发性有机物的影响对高粱设置接种AM真菌(G.mosseae或G.intraradices)和不接种处理。通过顶空固相微萃取结合气质联用技术,从高粱根系中共鉴定出44种挥发性有机物(VOCs),其中对照18种,接种G.mosseae的21种,接种G.intraradices的17种。3个处理中,直链烷烃类化合物均是根系释放的最主要的挥发物,分别占VOCs总量的73.6%(对照)、56.8%(接种G.mosseae)和34.9%(接种G.intraradices)。与未接种AM真菌的植物比较,接种AM真菌后根系释放更多醇类和酸类物质;未接种AM真菌的根系没有检测到支链烷烃类物质;接种AM真菌的根系中没有检测到醛类物质。这些结果说明AM的形成能够改变根系释放的VOCs,并且这种改变有菌种特异性。6.AM中转录因子LjMAMI的功能分析使用原核表达体系构建LjMAMI蛋白体外表达载体,利用Denaturing方法提取纯化了LjMAMI蛋白。通过EMSA试验初步验证了LjMAMI蛋白能够结合MYCS和P1BS两个位于LjPT4基因启动子区域的顺式作用元件,为LjMAMI蛋白调控LjPT4基因的表达提供了依据。对LjMAMITILLING(TargetingInducedLocalLesionsINGenomes)突变体的表型分析发现,2084突变体幼苗茎的分枝数相对野生型植物显著增加,是野生型的1.3倍;随着幼苗的生长,茎分枝的区别逐渐消失,说明这种性状可能仅在幼苗期出现。成苗期的突变体相比野生型植物,生长滞后,植株矮小,说明LjMAMI可能参与植物的生长调控。7.AM特异性诱导的LjPT4的功能分析通过RNA干扰技术成功抑制了LjPT4的表达,突变体中LjPT4的表达量仅为对照的14.6%。利用荧光染色和激光扫描共聚焦显微技术发现,LjPT4被部分沉默后丛枝败育,突变体中消解丛枝比例为74.6%,与对照差异极显著,说明LjPT4对维持AM中丛枝的形态有重要功能。TBO染色发现,多聚磷酸盐(Polyphosphates)在LjPT4突变体的丛枝细胞中大量累积,不能转运到植物细胞,说明LjPT4对共生体中磷酸盐的转运不可或缺。当LjPT4被部分沉默后,根系的形态没有发生变化,而且当植物接种AM真菌后,突变体根系生物量与对照也没有明显区别。另外,当LjPT4基因的表达量下降时,LjMAMI的表达量同样下降。
【作者】孙学广;
【导师】唐明;
【作者基本信息】西北农林科技大学,森林保护学,2014,博士
【关键词】挥发性物质;双重培养体系;信号识别;根系分枝;磷酸转运蛋白;

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