小菜蛾肠道细菌多样性分析及两株细菌的杀虫活性研究

【摘要】小菜蛾，学名Plutellaxylostella（Linnaeus），属鳞翅目菜蛾科昆虫，是十字花科蔬菜特别是甘蓝类蔬菜上的重要害虫。小菜蛾肠道内，分布着各式各样的微生物，主要种类是细菌，且可能存在与寄主互利共生的关系，但这些细菌的优势种类及与寄主之间的相互作用，并不十分明确。为了解小菜蛾体内细菌种类多样性信息，我们采用了传统的细菌平板培养法和分子技术变性梯度凝胶电泳这两种方法对小菜蛾肠道细菌的优势种类进行了系统分析。小菜蛾各个虫态的体内都有大量的细菌存活。田间采集小菜蛾肠道中的细菌数量高于实验室种群，不管是田间种群还是实验室种群，肠道中可培养的细菌数量均为幼虫>成虫>蛹。最终分离25个细菌纯培养，其中从幼虫肠道中分离出20种细菌，蛹中8种，成虫14种，不同虫态可培养细菌存在差异。厚壁菌门细菌为最优势的种类，其中Bacillus芽孢杆菌属是可培养细菌中的最优势菌属。通过PCR-DGGE手段，分离到15个优势细菌的16SrRNA序列，序列比对结果和系统发育分析表明这些细菌序列属于3个门6个属以及3种环境中不明确样本unculturedbacteria。实验结果表明，变形菌门的沙雷氏菌（Serratia）在幼虫肠道中分布最为广泛，Serratia和Pseudomonas在肠道细菌数量上占据优势地位。在蛹中，unculturedbacteria最优势种类，成虫中unculturedbacteria和Serratia是最优势细菌种类，这些优势细菌种类可能在小菜蛾体内发挥着重要作用。传统的培养方法和分子鉴定手段结合利用和可以有效地用于分析肠道微生物群落结构的多样性。我们测定了五种抗生素以及不同的抗生素浓度对小菜蛾幼虫肠道细菌除菌作用以及细菌种群结构多样性的变化。摄入利福平和硫酸链霉素的幼虫，其肠道细菌数量降低的最为明显，氯霉素、氨苄青霉素和四环素的除菌效果比较接近，效果相对较差。随着抗生素使用浓度的增加，肠道细菌去除效果亦显著提高，毒害作用表现更加明显。抗生素的摄入对小菜蛾的生长发育等有明显的影响。能导致幼虫的死亡，平均蛹重降低，还可导致蛹严重畸形，羽化困难。我们认为链霉素对小菜蛾幼虫的毒害作用较轻，利福平次之，四环素毒害作用明显，不建议在该昆虫相关实验中使用。抗生素对一些优势种类细菌去除效果不佳。用DGGE电泳分析了饲喂抗生素后幼虫肠道细菌群落多样性变化发现，甘蓝组幼虫肠道细菌的种类最为丰富，不同的食物影响了肠道细菌种群结构，饲料组和抗生素组的细菌丰富度明显降低。氨苄青霉素（AMP）处理组的幼虫肠道细菌多样性变化不大，硫酸链霉素，利福平和四环素处理组的细菌多样性低于其他组别。通过饲料添加抗生素饲喂幼虫10d，幼虫体内的细菌DNA仍能检出。我们从采集的死蛹体内分离到2株细菌，P1细菌经鉴定可能为Pseudomonascedrina，P2细菌的序列信息则与短小芽孢杆菌Bacilluspumilus最为相似。P1细菌生长速度最快，接种4-6h后，进入对数生长期，苏云金杆菌（BT）在接种6-8h后进入对数生长期，P2细菌生长速度最慢。随菌液OD的增加，幼虫死亡率升高，P1组升高尤为明显，P2组中，不同的OD值菌液喂食后，幼虫死亡率较为接近。因初始接种量较多，P1对小菜蛾幼虫的毒害作用甚至优于BT，但当把菌体离心去除后，上清液的毒性明显下降，幼虫死亡率较低，说明上清液中的有毒物质含量较少，可能是该细菌菌体中含有某种杀虫活性物质。P2组的上清液或菌液对幼虫校正死亡率都较低，但差别不明显，说明该细菌释放了某种杀虫活性物质。
【作者】林晓丽；
【导师】刘同先；
【作者基本信息】西北农林科技大学，有害生物治理生态工程，2014，博士
【关键词】小菜蛾；肠道细菌；细菌多样性；DGGE；抗生素；杀虫活性；

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