逆境胁迫下小麦脱水蛋白wzy1-2、wzy2基因及启动子的功能研究

【摘要】脱水蛋白，属于LEAII家族蛋白，是一类逆境相关蛋白，在植物逆境胁迫防御过程中发挥重要作用。当植物遭受逆境胁迫时，脱水蛋白会在植物组织中积累。为了阐明其在逆境胁迫条件下的作用机制，本研究以郑引1号和Xinchun9小麦品种为试验材料，分别开展了对脱水蛋白wzy1-2、wzy2基因及启动子的克隆、抗逆功能的研究，结果如下：1)wzy1-2、wzy2基因全长、启动子序列克隆及序列分析在wzy1-2、wzy2cDNA序列的基础上，克隆得到wzy1-2、wzy2基因全长。克隆得到的wzy1-2基因全长为1255bp，包含1个103bp内含子，位于编码S片段的核苷酸之间，0相位，两端边界为GT-AG；wzy2基因全长为928bp，包含1个109bp内含子，位于编码S片段的核苷酸之间，0相位，两端边界为GT-AG。PCR扩增得到wzy1-2启动子序列长度为719bp，转录起始位点(TSS)位于翻译起始位点(ATG)上游107bp处。PlantCAREDatabase分析表明，该序列包含启动子保守元件TATA-box和CAAT-box，有1个TATA-box，位于TSS上游－26±7bp处；6个CAAT-box，分别位于TSS上游－562±8bp，－545±7bp，－506±8bp，－459±8bp，－445±8bp和－420±6bp处。wzy1-2启动子序列中含有若干与逆境胁迫相关顺式作用元件，分别为ABREs、MBS、LTREs、TGACGmotifs、GAREmotifs、SAREs和TC-richrepeats等。克隆得到的wzy2启动子序列长度为633bp，TSS位于ATG上游75bp处。将该序列(包括ATG)输入PlantCAREDatabase分析表明，该序列包含启动子保守元件TATA-box和CAAT-box，有1个TATA-box，位于TSS上游－26±7bp处；3个CAAT-box，分别位于TSS上游－450±6bp，－421±6bp和－414±6bp处。wzy2启动子序列中含有若干与逆境胁迫相关顺式作用元件，分别为ABREs、GC-motifs、LTREs、TGAelements、TGACGmotifs和TGGmotifs等。2)不同逆境胁迫下小麦脱水蛋白wzy1-2、wzy2基因表达分析经qRT-PCR试验分析显示，在正常条件下wzy1-2基因有少量表达。当用渗透胁迫(PEG6000)、低温(4℃)、MeJA、ABA、GA和SA处理时，可以大量诱导其表达；在正常条件下wzy2基因几乎不表达，但当低温(4℃)、厌氧(N2)、生长素(IAA)、MeJA、ABA和GA处理时，可大量诱导该基因的表达。研究结果表明，wzy1-2、wzy2启动子均属逆境胁迫诱导启动子。3)干旱/脱水、低温和ABA处理YSK2型脱水蛋白wzy2诱导表达模式分析分别对小麦植株采用20%PEG6000处理和外源ABA诱导处理wzy2基因表达分析及脱水-复水处理下小麦植株内源ABA含量测定结果表明，YSK2型脱水蛋白wzy2直接受ABA和低温诱导，而间接被干旱/脱水诱导。4)小麦脱水蛋白wzy1-2、wzy2启动子活性及功能元件缺失分析分别对wzy1-2、wzy2启动子缺失体进行瞬时表达分析，结果表明，在正常条件下wzy1-2启动子具有一定的启动子活性，wzy2启动子不具有启动子活性；wzy1-2启动子受干旱和激素(ABA、SA和GA)胁迫诱导，且这些逆境因子可能通过该启动子上相应的应答元件ABREs、SAREs、GAREmotif和MBS调控该基因表达；wzy2启动子受低温、厌氧和激素(ABA和GA)胁迫诱导，推测这些逆境因子可能是通过该启动子上的应答元件LTREs、GCmotifs、ABREs和TATCboxes调控该基因表达。有趣的是，脱水蛋白wzy2启动子驱动GUS瞬时表达在拟分生组织中被观察到，而不是在厌氧胁迫处理的小麦愈伤组织中，此研究结果属首次发现。5)不同逆境条件下小麦脱水蛋白WZY1-2表达分析利用SDS-PAGE和WesternBlotting分析不同逆境条件下WZY1-2蛋白的表达情况，结果表明，在正常条件下，WZY1-2蛋白有少量组成性表达；同时，WZY1-2蛋白分别可被渗透逆境/脱水(PEG6000)、低温(4℃)、ABA、MeJA和SA诱导大量表达，而GA却抑制WZY1-2蛋白表达在翻译水平。结合脱水蛋白wzy1-2基因表达分析结果可知，在MeJA、渗透逆境/脱水、ABA和SA处理条件下，wzy1-2在转录水平和翻译水平的表达积累是不同步的，WZY1-2蛋白积累存在滞后性。但在低温处理下，wzy1-2转录水平积累存在滞后性，暗示低温条件下可能有多条逆境信号代谢途径交叉调控WZY1-2蛋白表达。
【作者】朱维宁；
【导师】张林生；
【作者基本信息】西北农林科技大学，生物化学与分子生物学，2014，博士
【关键词】小麦；脱水蛋白；启动子；顺式作用元件；逆境响应；

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