苹果蠹蛾解毒酶基因的克隆及功能研究

【摘要】苹果蠹蛾Cydiapomonella是世界上最重要的经济害虫之一，几乎遍布绝大多数梨果科果树种植地区。该虫寄主谱广，以幼虫蛀果危害，并造成大量落果，对全球水果种植业造成巨大的经济损失。世界范围内防治苹果蠹蛾的主要依赖于化学杀虫剂，然而频繁的使用化学杀虫剂使得苹果蠹蛾对这些化学杀虫剂产生了严重的抗药性。前人对苹果蠹蛾抗性机制的研究表明解毒酶包括细胞色素P450氧化酶、谷胱甘肽转移酶（GST）和酯酶（EST）的活性升高是抗性形成的主要机制。然而，苹果蠹蛾解毒酶基因的克隆和功能方面的研究至今仍是空白。因此，研究我国西北地区苹果蠹蛾种群的抗药性现状对我国苹果蠹蛾抗性治理具有重要的指导意义；从分子和生化水平对解毒酶基因的功能进行研究，为揭示苹果蠹蛾抗性机制奠定一定的基础。为评估我国西北地区苹果蠹蛾种群的抗药性现状，研究苹果蠹蛾解毒酶基因在杀虫剂代谢及潜在的抗性中的作用，本文通过生物测定和酶活性分析确定了我国西北地区苹果蠹蛾种群对常用杀虫剂的敏感性，并采用RT-PCR和RACE策略克隆了苹果蠹蛾解毒酶基因CYP9A61、CpCE-1和CpGSTd1，利用RT-qPCR研究了三个解毒酶基因的时空表达模式，以及杀虫剂处理后解毒酶基因表达水平的变化；分析了杀虫剂处理三大解毒酶系酶活性的影响。采用原核表达系统异源表达了苹果蠹蛾解毒酶基因，并从分子和生化水平上研究其对模式底物、有机磷和拟除虫菊酯类杀虫剂的酶促水解特性；构建了解毒酶基因的3D模型，并通过氨基酸定点突变和计算机分子模拟相结合，从结构上深入地研究并揭示关键氨基酸突变对模式底物和杀虫剂水解的影响。主要研究结果如下：1.我国西北地区苹果蠹蛾种群抗性调查采用生物测定对我国西北地区4个苹果蠹蛾田间种群对高效氯氟氰菊酯、甲基毒死蜱、西维因和吡虫啉的抗性进行了调查，表明田间种群对甲基毒死蜱和西维因敏感性下降；酶活性测定表明4个田间种群谷胱甘肽转移酶(GST)活性明显升高，而Zha,Wuw和Lan种群羧酸酯酶(CarE)活性以及Wuw种群乙酰胆碱酯酶活性均低于实验室品系；突变检测表明乙酰胆碱酯酶(AChE)ace1基因F399位点以及羧酸酯酶基因CpCE-1A121和W233位点均未发生氨基酸突变；Native-PAGE表明不同种群间存在CarE同工酶且AChE对底物的敏感性不同。2.苹果蠹蛾细胞色素P450基因克隆及表达模式研究克隆得到了苹果蠹蛾中的第一个P450基因，命名为CYP9A61。该基因cDNA全长为2071bp，开放阅读框（ORF）编码538个氨基酸。序列分析表明CYP9A61与已报道的CYP9s氨基酸同源性达51%–60%，并包含高度保守的底物识别位点SRS1，SRS4和SRS5。实时定量PCR结果表明CYP9A61在5龄中的表达量为1龄中的67倍，在丝腺和脂肪体中高于其它组织。3龄幼虫CYP9A61表达量在12.5mgL1乙基毒死蜱处理60小时和0.19mgL1高效氯氟氰菊酯处理36h后，分别上调了2.20和3.47倍；此外，杀虫剂处理后苹果蠹蛾3龄幼虫的细胞色素P450活性明显升高。表明CYP9A61与杀虫剂的解毒代谢有关。3.苹果蠹蛾羧酸酯酶基因及5′侧翼序列的克隆与表达模式研究克隆得到了苹果蠹蛾B型羧酸酯酶基因CpCE-1cDNA，该基因全长1978bp，ORF编码545个氨基酸。序列分析表明CpCE-1与已报道的昆虫羧酸酯酶具有较高的氨基酸同源性，且包含一些高度保守的区域，如催化三分子和GXSXG五肽。绝对定量PCR表明CpCE-1主要在蛹期和成虫期大量表达，且雌虫重表达量高于雄虫；CpCE-1在表皮、中肠和头部中表达量高于其它部位。3龄幼虫CpCE-1表达量以及羧酸酯酶活性在12.5mgL1甲基毒死蜱和0.19mgL1高效氯氟氰菊酯处理后均明显升高。通过热不对称PCR（TAIL-PCR）克隆得到CpCE-1基因5’-侧翼序列，该序列中包含许多转录因子结合位点，如热激因子HSF、致畸区域Dfd、三元复合体TCF、广谱复合物BR-CZ4、Hb、TATA、CAAT、GATA、锌指蛋白CF2-Ⅱ、TFⅡD和tramtrack69，以及一些与发育和形态相关的转录元件。4.苹果蠹蛾CpCE-1蛋白的表达及对杀虫剂代谢功能研究我们在含0.6mM山梨醇的培养基中以18℃诱导培养，在大肠杆菌BL21(DE3)中融合表达了CpCE-1蛋白，并采用Ni2+-NTA琼脂糖柱亲和纯化了融合蛋白CpCE-1。CpCE-1对ɑ-乙酸奈酯(ɑ-NA)的催化效率kcat/Km值为100s-1μM-1，对β-乙酸奈酯(β-NA)的催化效率kcat/Km值为29.78s-1μM-1;以ɑ-NA为底物，酶最大反应速率Vmax和米氏常数Km值分别为12.9μmol/min/mg和13.4μM。CpCE-1的最适反应pH和温度分别为7.0和25℃。蛋白酶抑制剂PMSF和DEPC，以及杀虫剂氯氰菊酯、灭多威和乙酰甲胺磷明显的抑制CpCE-1活性，而金属离子Cu2+和Mg2+则明显的激活CpCE-1活性。分子动力学模拟(MD)和计算丙氨酸扫描(CAS)表明CpCE-1中Asn233氨基酸残基接近为一个热点“hot-spot”，它的结合自由能差值(ΔΔGbind)为3.66kcal/mol。利用定点突变技术，我们得到了N232A及其它突变体蛋白。N232A突变体的催化效率kcat/Km明显低于野生型CpCE-1，仅为17.91s-1μM-1。乙酰甲胺磷对野生型CpCE-1的抑制中浓(IC50)值为42.18μM，而对N232A的IC50高于10000μM。计算得到的N232A结合自由能差值(ΔΔGbind)为3.17kcal/mol，与计算机模拟值接近。体外代谢试验表明野生型CpCE-1能够代谢乙酰甲胺磷，而N232A不能代谢乙酰甲胺磷，说明Asn232是与乙酰甲胺磷代谢的关键氨基酸残基。5.苹果蠹蛾CpGSTd1蛋白的表达及对杀虫剂代谢功能研究克隆得到了苹果蠹蛾Delta家族的GST基因CpGSTd1，该基因ORF为648bp，编码一个215个氨基酸的GST蛋白。实时定量PCR结果表明CpGSTd1随发育阶段增加表达量上升，且在中肠和丝腺中表达量高于其它部位。3龄幼虫CpGSTd1表达量在12.5mgL1甲基毒死蜱和0.19mgL1高效氯氟氰菊酯处理后均明显升高；杀虫剂处理后苹果蠹蛾3龄幼虫的GST活性发生明显变化。我们在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中融合表达了CpGSTd1蛋白，并采用Ni2+-NTA琼脂糖柱亲和纯化了融合蛋白CpGSTd1。该蛋白对CDNB的催化常数kcat和催化效率kcat/Km分别为3.66×104min-1和1.37×105min-1mM-1。高效氯氟氰菊酯和甲基毒死蜱对CpGSTd1的IC50值分别为0.18和0.26mM。体外代谢试验表明CpGSTd1能够代谢高效氯氟氰菊酯，而不能代谢甲基毒死蜱。同源模建和分子对接得到的结合模式表明，高效氯氟氰菊酯和甲基毒死蜱分别结合于CpGSTd1的H位点和G位点。结合自由能分析表明，CpGSTd1与高效氯氟氰菊酯的结合能力强于甲基毒死蜱，其结合自由能ΔGbind分别为-28.26和-16.08kJ/mol。本研究表明，CpGSTd1与苹果蠹蛾代谢杀虫剂的相关。
【作者】杨雪清；
【导师】张雅林；
【作者基本信息】西北农林科技大学，农业昆虫与害虫防治，2014，博士
【关键词】苹果蠹蛾；解毒酶；抗药性；分子模拟；代谢；

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