糖尿病对内皮祖细胞不同细胞亚群数量及EPCs表达TLR4的影响以及SDF-1对EPCs移植疗效的影响研究

【摘要】目的：构建经济、高效的脐带血来源的内皮祖细胞分离、培养平台,为今后的糖尿病患者的异体移植提供基础；对比糖尿病不同并发症患者之间以及糖尿病患者与对照人群之间的不同EPCs亚群的数量,并分析EPC亚群细胞数量与糖尿病并发症的相关性；对比糖尿病大鼠与正常大鼠EPCs表达TLR4、eNOS的差异,及LPS刺激对EPCs的TLR4/NF-KB的影响；比较SDF-1α共培养对EPCs的影响,以及SDF-1α预处理的EPCs移植对糖尿病大鼠下肢缺血的疗效。方法：通过改良的密度梯度离心法和羟乙基淀粉结合密度梯度离心法分离人脐带血中的单个核细胞,按1.0×106/cm2接种于鼠尾胶包被的培养皿中,用EGM-2培养基进行诱导培养7天,进行细胞鉴定、检测。采用流式细胞仪检测糖尿病患者及非糖尿病对照人群的外周血CD34+、CD133+、KDR+及CD133+KDR+细胞数量,对比分析不同糖尿病并发症之间以及糖尿病与对照组之间,各细胞亚群数量的变化。动物实验部分,采用大鼠骨髓单个核细胞定向培养为内皮祖细胞(EPCs):1)对比观察来源于糖尿病大鼠和正常大鼠的Epcs勺增殖能力、黏附能力,细胞表面TLR4的表达、分泌IL-6、TNF-α及eNOS的量；观察EPCs、巨噬细胞及两种细胞的混合细胞培养时,分别加入不同浓度LPS,观察细胞TLR4、NF-κBvIL-6、TNF-α的表达量；2)使用lOng/mlSDF-1α与EPCs共培养48小时,观察EPCs勺增殖能力、黏附能力的变化。以糖尿病大鼠为对象,采用股动脉结扎法制造糖尿病下肢缺血大鼠模型,使用SDF-1α预处理的EPCs多点肌肉注射,动脉造影法观察下肢血管变化,评估细胞移植的治疗效果。结果：采用改良的细胞分离及培养方法,可以成功获得内皮祖细胞,并且可以使人脐带血来源的内皮祖细胞培养的细胞活率达99.3%±0.33%；脐带血源收获细胞数量高于外周血；细胞的增殖峰也明显高于外周血来源的内皮祖细胞。糖尿病患者外周血EPC数量明显低于对照组,LDL-c,BMI,腰围和尿微量白蛋白浓度与糖尿病组EPC数量呈负相关。不同的糖尿病并发症的EPC亚群细胞数量有所不同。糖尿病大鼠与正常对照大鼠骨髓单个核细胞来源的内皮祖细胞培养结果比较显示：糖尿病大鼠EPCs数量较正常对照组明显减少(29.21±1.56vs49.08±5.83)/(视野×200)(P<0.05)。糖尿病组大鼠EPCs的增殖能力(0.51±0.05vs0.69±0.02)和黏附能力(28.03±3.51vs46.24±2.51)/(视野×200)均较正常对照组低(P<0.05)。糖尿病组EPCs的eNOS活性显著低于正常对照组(1.47±0.46vs3.23±0.74U/ml)(P<0.05)。糖尿病组EPCs的TLR4表达显著高于正常对照组(3.8%vs1.6%)(P<0.05)。而糖尿病组EPC培养基中IL-6、TNF-α浓度均高于对照组,其中两组间IL-6表达量有统计学差异：IL-6(pg/ml),1039±28vs675±32,P<0.05;TNF-α(pg/ml),216±31vs198±29。不同浓度LPS刺激EPCs、巨噬细胞及两种混合培养细胞,结果显示,内皮祖细胞比巨噬细胞有更高的TLR4表达率,低浓度LPS(10ng/ml)对EPCs已产生有效刺激；TLR4高表达的同时,相应培养基中有IL-6、TNF-α浓度的增加,以IL-6浓度增加更明显。SDF-1α对EPCs功能影响的观察显示,lOng/mlSDF-1α即能显著增加EPCs的增殖能力和黏附能力。对比观察生理盐水、无预处理的EPCs和SDF-1α预处理的EPCs移植治疗糖尿病大鼠下肢缺血性疾病,动脉造影结果显示,生理盐水组血管数为4.0±2.3；EPCs移植组血管数为9.1±2.8;SDF-1α共培养的内皮祖细胞移植组血管数为12.9±2.3；三组间血管数比较,EPCs组和SDF-1α共培养的内皮祖细胞组多于生理盐水组,并有统计学意义(P<0.05);SDF-1α共培养的内皮祖细胞组多于EPCs组,差异有统计学意义(P<0.05)。三组肌肉总抗氧化能力、eNOS、一氧化氮检测结果显示,SDF-1α共培养的内皮祖细胞组的总抗氧化能力、一氧化氮高于EPCs组和生理盐水组。结论：1)采用改良的分离、培养方法可以由人脐带血获得充足来源的内皮祖细胞,其增殖及扩增能力更高,有更好的移植利用潜能；2)糖尿病伴有EPC数量的减少,但不同的糖尿病并发症时,EPC各亚群的细胞数量是不同的。LDL-c,BMI,腰围和尿微量白蛋白与EPC数量呈负相关性；3)糖尿病伴随着EPCs的数量减少以及增殖、黏附功能受损。糖尿病状态可以导致EPC高表达TLR4,使细胞处于低度炎症状态,同时减少eNOS分泌。LPS低浓度对EPCs即为有效刺激,巨噬细胞的TLR4表达低于EPCs,两种细胞的混合细胞共同培养时,LPS刺激可以产生出更多的TLR4表达,提示两种细胞可能存在促炎的协同作用；4)SDF-1α可以显著增强EPCs的粘附能力和增殖能力,SDF-1α对正常大鼠EPCs的粘附能力和增殖能力有增强作用,对糖尿病大鼠的EPCs也有相似作用；5)SDF-1α与EPC共培养后移植,提高糖尿病大鼠下肢缺血的疗效,糖尿病状态下,SDF-1α对EPCs的动员和归巢有促进作用。大鼠下肢血供改善主要来自于新生血管形成和／或原有细小血管的代偿性增粗。
【作者】王宁；
【导师】谢自敬；
【作者基本信息】新疆医科大学，内科学，2014，博士
【关键词】糖尿病；内皮祖细胞；TLR4；SDF-1α；移植；

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